電分析法同時快速測定植物油中TBHQ、BHA和BHT的研究

王佳蕊 郝雅茹 李書國

(河北科技大學生工學院，石家莊 050018)

近年來BHA、BHT的動物實驗研究表明，二者存在一定的安全性隱患，過量添加對人體健康有害，人工合成抗氧化劑濫用也是食品安全問題之一[1-2]。目前抗氧化劑的檢測方法有薄層層析法、比色法、氣相色譜法、液相色譜法、分光光度法等，各方法都需采用有機溶劑從樣品中將組分萃取分離出來，手續冗長，步驟多，不但繁雜，而且造成組分損失多，對結果的準確性影響大[1]。

電分析技術具有高的選擇性和靈敏度、檢測快捷方便的特點，在復雜體系中檢測微量化合物、有毒有害物質、生物性成分方面得到了應用，而酚類抗氧化劑都是電活性物質，電分析技術在抗氧化劑定量分析和抗氧化活性評價方面應用潛力巨大。國外學者對該法在抗氧化劑的定量分析進行了研究，認為是替代高效液相色譜法的重要方法。Agui等[3]利用微分脈沖伏安法同時測定脫水馬鈴薯片中的BHA和BHT的含量，二者在碳纖維微電極上的氧化峰電位差為300 mV；Fuente等[4]利用鎳酞菁修飾電極的催化作用測定油炸土豆片和玉米片中的TBHQ和BHA的含量，研究了聚吡咯修飾電極對TBHQ和BHA的電化學催化作用，確定了影響TBHQ和BHA氧化峰的主要因素，并應用于實際樣品的分析檢測，該法需要樣品粉碎、甲醇提取、離心分離等預處理步驟。Martin等[5]借助PLS法利用微分脈沖伏安法同時測定樣品中的BHA和PG；Diaz等[6]以酸性乙腈和水的混合物為介質，利用線性伏安法和PLS法同時測定了調味粉樣品中BHA、PG、BHT的含量，但該法需要研磨、篩分、提取、過濾等預處理；Ni等[7]利用電分析方法輔以化學計量學技術同時測定食用油和調味粉中的BHA、BHT、PG和TBHQ，但需要用乙腈從食用油和調味粉中提取、分離抗氧化劑，并且4種抗氧化劑在其選擇的介質和電極條件下，發生氧化峰重疊現象。

本實驗旨在研究BHA、TBHQ及BHT 3種酚類抗氧化劑的循環伏安性質、電極反應過程與機理，優化電分析法測定3種抗氧化劑的分析實驗條件，考查3種抗氧化劑的電分析信號之間相互干擾情況，驗證電分析法測定油脂抗氧化劑的可靠性。

1 材料與方法

1.1 化學試劑與材料

叔丁基羥基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)、特丁基對苯二酚(THBQ)、硫酸、無水乙醇、1，2-二氯乙烷、高氯酸鋰、乙酸：分析純；甲醇：色譜純；大豆油、花生油、菜子油、葵花子油、芝麻油：一級油。

1.2 儀器與設備

PAR 270電化學系統(EG & G M283型恒電位儀/恒電流儀、方正電腦及操作軟件M270電化學軟件)；三電極系統包括：玻碳圓盤電極為工作電極(直徑為3 mm)、鉑絲電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極；電化學池：自制；SR8001型電子分析天平； LC-20A高效液相色譜儀[檢測波長為280 nm，進樣量為5 μL，流動相為甲醇+乙酸-水(1∶99)，C18色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)]；JL-60DT型超聲波清洗機；QY-10型微量移液器。

1.3 方法

1.3.1 電極的處理

玻碳電極依次用1.0、 0.3、 0.05 μm的Alumina(Al2O3)粉研磨拋光，用超純水潤濕，接著進行超聲清洗處理，再用超純水和丙酮沖洗除去其表面吸附物質，使成鏡面，然后在0.2 mol/L 的硫酸溶液中用循環伏安法掃描處理，掃描速度為50 mV/s，電壓范圍為-0.5～+1.5 V，持續掃描約10 min，得到穩定的循環伏安圖后，取出用二次蒸餾水洗凈，室溫干燥后備用[8]。

1.3.2 標準加入法

TBHQ、BHA、BHT的標準溶液：準確稱取0.166 g TBHQ、0.18 gBHA、0.22 gBHT標準品加入到100 mL的容量瓶，用無水乙醇溶解并稀釋到刻度，其濃度為1.0×10-2mol/L，避光貯存備用；取0.40 mL的0.1 mol/L的硫酸乙醇溶液和1.0 mL的1.0 mol/L的高氯酸鋰乙醇溶液以及適量的TBHQ、BHA、BHT的乙醇溶液分別使其濃度達2.0×10-4mol/L，加入適量體積的1，2二氯乙烷到25 mL的容量瓶，使其達到25 %的比例，最后用乙醇稀釋至刻度要求。循環伏安圖在-0.6～1.2 V，20 mV/s的掃描速度下記錄；微分脈沖伏安圖在0.2～1.2 V，在10 mV/s的掃描速度下記錄。在空白樣和加入標準TBHQ、BHA、BHT溶液的樣品中，分別進行3次平行實驗，測量并記錄其氧化峰電流響應，計算其平均值做為TBHQ、BHA、BHT的氧化峰電流值。

為了得到3種抗氧化劑的線性校正曲線圖，分別在5×10-6～3.0×10-4mol/L 和1.5×10-5～3.0×10-4mol/L的濃度范圍內準備TBHQ、BHA和BHT的校正樣品集，然后利用微分脈沖伏安法測定每個樣品對應的氧化峰電流，并分別作出其校正曲線。油樣的TBHQ、BHA、BHT的濃度根據TBHQ、BHA、BHT的濃度與其氧化峰電流的校正曲線來確定，然后根據油樣的量換算成油脂中的抗氧化劑含量。

1.3.3 HPLC法測定植物油中的抗氧化劑

準確稱取植物油樣品1.000 g加入到10 mL帶塞的離心管內，加入甲醇5 mL混合均勻，以3 000 r/min的轉速離心處理10～15 min，取上層溶液轉移至25 mL的帶塞比色管中，再加入5 mL的甲醇于植物油樣品中重復提取一次，合并上層溶液，在4 ℃條件靜置除去凝固脂肪，然后將上層溶液轉移至旋轉蒸發儀的濃縮瓶濃縮并用甲醇定容至10 mL，用0.45 μm微濾膜過濾，最后取樣進行HPLC測定，每個樣品進行3次平行實驗。

1.3.4 電化學分析測定植物油樣品的抗氧化劑

在該方法中，商品植物油樣品無需任何預處理。稱取1.0～2.0 g的植物油樣品置于25 mL的容量瓶,隨后加入0.40 mL的0.1 mol/L硫酸的乙醇溶液，1.0 mL的1.0 mol/L高氯酸鋰的乙醇溶液和5 mL的1，2二氯乙烷，然后用乙醇稀釋到最終刻度?；旌先芤簲嚢璨⒂肗2純化5 min。每個油樣做3次平行實驗，計算其平均值作為最后測定的結果。除特別說明，所有實驗均在(25±0.5) ℃下進行，同時都在氮氣氛圍下進行。

2 結果與討論

2.1 TBHQ、BHA和BHT的伏安性質與電極反應過程

為了研究TBHQ、BHA和BHT的電化學性質，分別在-0.6～1.2 V的掃描電位范圍，記錄了150 μmol/LTBHQ、150 μmol/LBHA和180 μmol/LBHT在玻碳電極上的循環伏安圖如圖1所示，其中的支持電解質為含0.06 mol/L的LiClO4和2.0 mmol/L的硫酸溶液的乙醇與1，2二氯乙烷混合溶液。三者的循環伏安圖表明，TBHQ的氧化峰電位為590 mV，BHA的氧化峰電位為710 mV，BHT的氧化峰電位為1 050 mV，而三者只有一個還原峰，其峰電位值為-90 mV，這說明本實驗條件下，3種抗氧化劑的電化學性質是不可逆的；不同電位掃描速度下的循環伏安圖表明，三者的氧化峰電流值隨著掃描速度平方根的增加而增大，該現象說明3種抗氧化劑的電化學氧化過程屬于典型的擴散控制過程；隨著掃描速度的增加，氧化峰電位正移，抗氧化劑濃度增加也會使氧化峰電位正移?？寡趸镔|的氧化峰電位值取決于該化合物的氧化還原性質，反映提供電子給工作電極的能力和該物質的電化學反應活化能，氧化峰電位值與其抗氧化活性呈負相關的關系，因此根據圖1可知，TBHQ的抗氧化活性最高，其次是BHA，而BHT最低，這與其分子結構及酚羥基的數量有關，與其他文獻研究結果一致。

注：掃描速度為20 mV/s。圖1 BHQ、BHA和BHT在玻碳電極上的循環伏安圖

2.2電分析法測定抗氧化劑TBHQ、BHA和BHT的條件優化

2.2.1 溶劑的選擇

TBHQ、BHA和BHT屬于脂溶性抗氧化劑，只能溶解于純的有機溶劑如乙醇、甲醇、乙腈及其混合物。酸性乙腈-水和高氯酸-甲醇(1.0%)混合溶劑都被應用于測定食品中3種或4種抗氧化劑，但在這兩種情況下，都要涉及食品樣品的粉碎、溶解、分離、抗氧化劑的提取等預處理，并且所得到的混合物循環伏安圖出現重疊現象，對分析造成不利影響。在本研究中，選擇合適的介質對電分析法測定3種抗氧化劑十分重要，要求其滿足以下條件：1)能夠溶解適量植物油樣品及其中的抗氧化劑，以獲得均一的溶液；2)所用溶劑要有好的介電特性；3)能夠溶解所選的支持電介質以獲得導電性好的溶液，以降低遷移電流對電化學反應的法拉第電流的影響和干擾。因此，本實驗分別選擇了乙醇-1，2二氯乙烷混合溶劑和乙腈溶液，電解質均為LiClO4以提高分析溶液的導電性，記錄其微分脈沖伏安圖如圖2所示。結果表明，乙腈作為溶劑時，加入油樣產生分層現象，同時其微分脈沖伏安圖中的TBHQ和BHA的氧化波峰發生重疊，而乙醇-1，2二氯乙烷混合物作為溶劑時，不但能較好地溶解0.5～1.5 g的油樣，而且其微分脈沖伏安圖的3個氧化峰峰形好，電位差較大，所以選擇乙醇-1，2二氯乙烷混合物作為適宜溶劑。為了確定乙醇和1，2二氯乙烷的最佳比例，分別對不同比例的乙醇-1，2二氯乙烷溶劑(加入1.5 g油樣)進行研究，結果表明，當混合溶劑中1，2二氯乙烷的比例低于25%時，加有油樣的混合溶劑就會變混或出現絮狀沉淀，所以選擇乙醇-1，2二氯乙烷混合物作為適宜溶劑，最佳比例為3∶1。

注：1為0.06 mol/L LiClO4的乙醇-1，2二氯乙烷溶液，pH 3.0；2為0.1 mol/L LiClO4的乙腈溶液，均加入1.0 g的油樣。圖2 TBHQ、BHA和BHT在不同介質中的微分脈沖伏安圖

2.2.2 溶液pH值對抗氧化劑伏安性質的影響

利用微分脈沖技術研究溶液的pH對抗氧化劑TBHQ、BHA和BHT的電化學響應的影響，所選pH范圍為2.0～7.0，電位掃描速度為10 mV/s。以BHA為例，其微分脈沖伏安圖表現出了一個峰形良好的氧化峰。峰電位隨著溶液的pH值增加而下降，當溶液pH值從7.0到2.0，BHA的氧化峰電流逐漸增加到最大，然后基本保持不變。pH值對TBHQ和BHT的伏安性質的影響與此情況類似。本實驗選擇溶液pH 2.0為最佳值，用于進一步研究。

注：1～5分別表示pH 7.0、pH 5.0、pH 4.0、pH 3.0、pH 2.0，掃描速度為10 mVs-1，脈沖幅值為 25 mV。圖3 分析底液pH對BHA氧化峰電流和峰電位的影響

2.2.3 支持電解質濃度對抗氧化劑伏安性質的影響

分析溶液中加入支持電解質有利于提高其導電性能，減小遷移電流，從而有利于電化學氧化響應電流的測定。本實驗分別研究了LiCl和LiClO4對抗氧化劑的伏安性質的影響，抗氧化劑BHA在LiClO4溶液的電化學響應信號明顯高于同濃度的LiCl的信號，所以本實驗選擇LiClO4作為支持電解質。為了確定LiClO4的適宜濃度，利用微分脈沖伏安圖研究了BHA在不同濃度(0.02～0.08 mol/L)LiClO4的伏安性質。如圖4所示，BHA的微分脈沖伏安圖在所研究的電位范圍內，表現出一個峰形良好的氧化峰，峰電流隨著支持電解質濃度的增加，BHA的氧化峰電流顯著增大，這主要歸因于溶液的導電性能的提高，此外背景電流有所下降。BHA的氧化峰電位略微向負電位方向移動。TBHQ和BHT的伏安性質對支持電解質濃度變化的響應與BHA類似，在其后的實驗研究中選擇0.08 mol/L LiClO4。

注：1～4分別表示0.02、0.04、0.06、0.08 mol/L LiClO4，pH 7.0，電位掃描速度為10 mV/s，脈沖幅度為25 mV。圖4 BHA在不同支持電解質濃度的溶液中的微分脈沖伏安圖

2.2.4 電分析儀器參數對抗氧化劑伏安性質的影響

微分脈沖伏安技術由于其能有效地降低背景電流，可以提高電流測量的精確度和靈敏度，因此選擇微分脈沖技術進行TBHQ、BHA和BHT的分析，TBHQ、BHA和BHT的微分脈沖伏安圖如圖5所示，它們的氧化峰電流隨著脈沖幅度的增加而顯著增加，在低電位掃描速度和較大的脈沖幅度時，其伏安圖的峰形變得更尖銳、更窄、更陡，因此為了降低TBHQ、BHA和BHT之間的氧化波峰之間的重疊程度，擴大其電位差，以獲得高的靈敏度，選擇50 mV為最佳脈沖幅度。綜合考慮測試分析速度和峰形兩種因素，選擇10mV/s為適宜電位掃描速度。

綜合考慮，確定乙醇-1，2二氯乙烷(3∶1)，支持電解質為0.08 mol/L LiClO4，溶液的pH為2.0，電位掃描速度為10 mV/s，脈沖幅度為50 mV為最佳的電分析參數，在此條件下分析3種抗氧化劑TBHQ、BHA和BHT，可以獲得3個形狀良好、電位差較大的3個氧化波峰，從而獲得較高的靈敏度。

注：1表示掃描速度10 mV/s，脈沖幅度 25 mV；2表示掃描速度5 mV/s，脈沖幅度50 mV。圖5 不同電分析儀器參數時TBHQ、BHA和BHT的微分脈沖伏安圖

2.3抗氧化劑的氧化峰電流響應與其濃度之間的關系

根據標準加入法，分別制備TBHQ、BHA和BHT的不同濃度的油樣(同一濃度的油樣做3次平行實驗)。在選定的溶液和實驗條件下即電位掃描速度為10 mV/s和脈沖幅度為50 mV，分別記錄TBHQ、BHA和BHT在玻碳電極上的微分脈沖伏安圖，并測量其氧化峰電流的值，每個峰電流平行測定3次并記錄，計算3次測量結果的平均值，以其作為該抗氧化劑的峰電流響應。根據每一種抗氧化劑的氧化峰電流響應值對應其濃度做圖，得到其線性校正模型和統計結果如表1所示，利用單因素回歸分析法分析。

表1 3種抗氧化劑的氧化峰電流與其濃度之間的校正曲線

注：y表示峰電流/μA ;x表示摩爾濃度/μmol/L。

2.4 3種抗氧化劑之間電化學響應信號的相互干擾的情況

TBHQ、BHA和BHT混合物的循環伏安圖和微分脈沖伏安圖都表現出了3個形狀良好的氧化波峰，在TBHQ氧化波峰的后半部分與BHA氧化波峰的前半部分發生小部分重疊，三者的氧化峰電位差也大于等于100 mV，一般來說，可以獲得各自獨立的電化學響應信號，但由于3種抗氧化劑具有相似的結構，同時相互之間具有抗氧化增效作用，在定量分析時，需要考慮相互之間的干擾情況。

進一步考查3種抗氧化劑之間的干擾程度，分別記錄了同濃度的TBHQ、TBHQ和BHA混合物、TBHQ、BHA和BHT混合物的微分脈沖伏安圖如圖6所示。根據圖6中的3個伏安圖可以看出，溶液中加入等濃度的BHA會引起TBHQ的氧化峰電流響應的增加(增加約10%)，而再加入等濃度的BHT時，TBHQ的氧化峰電流響應基本保持不變，BHA的氧化峰電流略有下降，這是由于在氧化過程中，TBHQ與BHA、BHA與BHT的相互作用的結果；圖6中還可以看出BHA及BHT的加入對TBHQ的氧化峰電位影響不明顯，TBHQ與BHA、BHA與BHT的氧化峰電流之間產生相互干擾?；瘜W計量法能夠有效地減少或消除分析物之間的相互作用的影響，所以利用電分析技術和化學計量技術可以測定3種或多種抗氧化劑混合物中的每一種抗氧化劑。

注：1～3分別表示120 μmol/L TBHQ、120 μmol/L TBHQ+60 μmol/L BHA、120 μmol/L TBHQ+60 μmol/L BHA+130 μmol/L BHT，電位掃描速度為10 mV/s，脈沖幅度為50 mV。圖6 微分脈沖伏安圖

2.5電分析法結合化學計量技術預測混合樣品中的抗氧化劑

偏最小二乘回歸(PLS)是對一般最小二乘回歸的擴展，是集多因變量對多自變量的回歸建模以及主成分分析為一體的多元數據分析方法，同時對響應測量矩陣A和濃度矩陣C進行主成分分解，提取主因子，并對主因子進行回歸，進一步提高了方法的可靠性。與其他方法相比，具有簡單穩健、計算量小、預測精度高、所構造的潛變量較確定、易于定性解釋等優點。己成為化學計量學中最受推崇的多變量校正方法之一。

2.5.1 校正模型的建立

為了利用電分析法對食用油樣品中的抗氧化劑TBHQ、BHA和BHT同時進行測量，首先建立化學計量學數學模型，然后用所建立的模型對樣品濃度進行預報。本實驗按L9(34)正交設計，分別配制9個不同濃度配比的3種抗氧化劑的校正組標準混合溶液和5個3種抗氧化劑預測組標準混合溶液(每個濃度配比的試樣配制3個)。其濃度如表2和表3所示。利用微分脈沖法依次記錄每個樣品的3個氧化峰電流值，每個樣品分別測量3次，取其平均值作為該樣品的各對應抗氧化劑的電流響應值，所測得數據用偏最小二乘法(PLS)建立數學模型[7]。

表2 TBHQ、BHA和BHT的校正組的濃度組成

2.5.2 混合模擬試樣PLS法預測分析結果

用PLS法數學模型對5組濃度配比不同的3種抗氧化劑的模擬試樣的各抗氧化劑濃度進行預測，濃度預測值、每種抗氧化劑相對預測誤差(RPEs)、總的相對預測誤差(RPET)及平均回收率等列于表3和表4。由表可以看出電分析法結合PLS法對不同濃度配比的不同模擬試樣的抗氧化劑TBHQ、BHA和BHT的預測回收率分別為102.6%、101.7%、100.6%，其相對預測誤差為2.39%、1.67%和1.56%，預測結果較好。

表4 PLS法預測模擬混合試樣的3種抗氧化劑的回收率、

2.6電分析法結合PLS法測定實際植物油樣品中的抗氧化劑

利用電分析法結合PLS技術和HPLC法同時測定了5種植物油：大豆油、花生油、菜子油、葵花子油和小麥胚芽油的抗氧化劑，2種方法的測定結果基本一致，如表5所示。2種或3種抗氧化劑組合如TBHQ-BHA或TBHQ-BHT添加入到植物油中，利用其抗氧化增效作用，提高油脂的氧化穩定性，而TBHQ是目前最常用的油脂合成抗氧化劑，在小麥胚芽油樣品中沒有檢測到合成抗氧化劑，這可能是因為小麥胚芽油中天然抗氧化劑-生育酚含量比較高，其穩定比較好。在所測定的植物油樣品中，回收率大約在94%～104.1%，這些結果表明該法在同時測定植物油中3種抗氧化劑方面是可行的，而且該法無需提取、分離及清洗等油樣預處理程序，是非常有應用潛力的方法。

表5 電分析法與PLS法聯用及HPLC法測定植物油樣品中的食品抗氧化劑

3 結論

3.1 抗氧化劑TBHQ、BHA和BHT的電極過程屬于典型的擴散控制過程，并且是不可逆的，3種抗氧化劑混合物的循環伏安圖表明，TBHQ的氧化峰電位最低，其次是BHA，BHT的氧化峰電位最高，而氧化峰電位的高低表明了其提供給電極電子的能力，與抗氧化活性呈負相關，所以3種抗氧化劑的抗氧化活性依次為TBHQ、BHA和BHT。

3.2 確定了電分析法測定植物油抗氧化劑的最佳分析實驗條件：乙醇-1，2二氯乙烷(3∶1)為溶劑，0.08 mol/L的LiClO4為支持電解質，溶液的pH值為2.0，微分脈沖伏安技術用于測定其氧化峰電流響應，其參數為：電位掃描速度為10 mV/s，脈沖幅度為50 mV。在此條件下確定了各抗氧化劑的氧化峰電流與其濃度之間的回歸數學模型、線性檢測范圍、最低檢測限等。

3.3 研究了TBHQ、BHA和BHT 3種抗氧化劑之間的相互干擾情況，BHA的加入會增加TBHQ的電流響應，增加量約10%，添加BHT對TBHQ的電流響應無影響，而對BHA的電流響應有一定影響，BHA和BHT的加入使TBHQ的氧化峰電位略微負移。

3.4 研究電分析法結合PLS法測定模擬試樣中的抗氧化劑，其預測濃度、檢測回收率和相對偏差結果，與HPLC法測定結果一致，效果較好，該法可有效消除了3種抗氧化劑之間的相互干擾，而且該法無需油樣的提取、分離和清洗等預處理程序，可以作為高效液相色譜法的重要替代方法。