麻黃湯不同配伍對苦杏仁和甘草有效成分的影響

麥榮國 郭曉鑾 招麗娟 林家壽 劉少文 張建偉

摘要 目的：評價麻黃湯不同配伍對苦杏仁和甘草有效成分的影響。方法：制備苦杏仁苷對照品溶液和甘草酸單銨鹽對照品溶液和不同配伍方式的麻黃湯水煎液供試品溶液，以正交設計8中不同配伍的麻黃湯組方，苦杏仁有效成分研究中以A-H進行標識;甘草有效成分研究中以A1-H1對8中不同配伍方式進行標實。最終結果根據國家藥典委員會提出的中藥指紋圖譜相似度評價系統2004A進行相似度分析，采用MATLAB軟件進行數據處理和統計。結果：苦杏仁和甘草色譜條件能夠分別將苦杏仁苷和甘草酸清晰的分離出來，無其他雜質峰，基線穩定，具有可比性。麻黃湯不同配伍方式中對苦杏仁有效成分苦杏仁苷每劑含量未見明顯差異，進行方差分析后結果顯示，麻黃湯不同配伍中麻黃、桂枝、甘草對苦杏仁苷的影響差異無統計學意義（P>0.05）。麻黃湯不同配伍方式中以H1單純甘草中甘草酸含量為最高，而麻黃湯全方A1中的甘草酸含量為最低;不同配伍中麻黃、桂枝和苦杏仁均降低麻黃湯中甘草酸的含量（P<0.05）。結論：麻黃湯不同配伍中麻黃、桂枝、甘草對苦杏仁中有效成分苦杏仁苷未見明顯影響;而不同配伍中麻黃、桂枝和苦杏仁均降低麻黃湯中甘草有效成分甘草酸的含量。

關鍵詞 指紋圖譜;麻黃湯;不同配伍;苦杏仁;甘草;苦杏仁苷;甘草酸單銨鹽;高效液相色譜法

Study on the Effects of Different Compatibility of Mahuang Decoction on the Active Ingredients

of Semen Armeniacae Amarum and Radix Glycyrrhizae Based on Fingerprint

Mai Guorong， Guo Xiaoluan， Zhao Lijuan， Lin Jiashou， Liu Shaowen， Zhang Jianwei

（Preparation Center of Foshan Chinese Medicine Hospital， Foshan 528216， China）

Abstract Objective：To evaluate the effects of different compatibility of Mahuang decoction on the effective components of Semen Armeniacae Amarum and Radix Glycyrrhizae based on the fingerprint of Chinese herbal medicine. Methods：Amygdalin reference solution and glycyrrhizinic acid standard solution and the different combination of Mahuang decoction test solution were prepared. 8 types of different combinations of Mahuang decoction were orthogonally designed， and A-H mark was used to effective ingredients of Semen Armeniacae Amarum; A1-H1 was marked to active ingredients of Radix Glycyrrhizae in different combinations Mahuang Decoction. Finally， the similarity analysis was carried out， according to the similarity evaluation system 2004A of traditional Chinese medicine fingerprints proposed by the national pharmacopoeia committee， and the MATLAB software was used for data processing and statistics. Results：1） The chromatographic conditions of Semen Armeniacae Amarum and Radix Glycyrrhizae could separate the amygdalin and glycyrrhizic acid respectively. There was no other impurity peak， and the baseline was stable and comparable. 2） There was no significant difference in amygdalin of Semen Armeniacae Amarum in each different Mahuang decoction. The variance analysis showed that there was no significant difference （P>0.05） in Herba Ephedrae， Ramulus Cinnamomi， Radix Glycyrrhizae in Mahuang decoction with different compatibilities. 3） H1 with pure glycyrrhizin content was the highest in different combination of Mahuang Decoction， while the contents of A1 with glycyrrhizic acid in Mahuang decoction were the lowest. Herba Ephedrae， Ramulus Cinnamomi， Radix Glycyrrhizae in different combination of Mahuang Decoction decreased the content of glycyrrhizic acid in Mahuang decoction （P<0.05）. Conclusion：Herba Ephedrae， Ramulus Cinnamomi and Radix Glycyrrhizae in different compatibility of Mahuang decoction had little significant effects on almond amygdalin; and they all decreased the contents of effective components of licorice of glycyrrhizic acid.

Key Words Fingerprint; Mahuang decoction; Different compatibility; Semen Armeniacae Amarum; Radix Glycyrrhizae; Amygdalin; Mono ammonium salt of glycyrrhizic acid; HPLC

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.048

麻黃湯這一出自醫圣張仲景的著名經典方劑，僅由四味藥組成，分別為麻黃、桂枝、苦杏仁、甘草;原文《傷寒論》中顯示麻黃湯用于太陽傷寒表實證，從現代醫學的角度來說麻黃湯可用于治療上呼吸道感染、流感、急性支氣管炎、支氣管哮喘等疾病[1-4]。麻黃湯四味藥物共奏發汗解表的功效，其中麻黃的藥性屬辛溫，通過發汗將外邪驅逐出肌表衛分;桂枝藥性辛溫，其色赤善發散可入營分散寒入衛分，而入衛分的外邪再隨麻黃而出衛分，邪祛疾病自愈;苦杏仁藥性屬苦溫，通過肅降肺氣，宣肺止咳;同時佐麻黃辛散;甘草調和諸藥，使諸藥合用邪氣祛解而正氣不傷[5-7]。而對于經方的研究，研究學者多通過拆方研究配伍關系對中藥配伍的藥理研究探索其配伍的后藥物有效成分的變化，探討配伍意義[8]。目前麻黃湯中藥指紋圖譜的研究較少，我們基于指紋圖譜研究麻黃湯不同配伍對苦杏仁、甘草有效成分的影響?，F報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號：HP1100，美國惠普公司）;甲醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）等均購自天津市康科德科技有限公司。

1.2 試劑

購自中國藥品生物制品檢定所的苦杏仁苷對照品（820-200002）和甘草酸單銨鹽（0731-9704）。

1.3 分析樣品

我院中藥房提供的麻黃科植物草麻黃的麻黃干燥草質莖，樟科植物肉桂的桂枝干燥嫩技，薔薇科植物山杏的苦杏仁干燥成熟種子，豆科植物甘草的甘草干燥根及根莖。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 苦杏仁有效成分指紋圖譜色譜條件 本研究選擇Hypersil ODS-C18柱（4.0 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱;流動相：甲醇-水（15∶85）作為流動相溶劑條件進行梯度洗脫，進樣體積為10 μL控制35 ℃柱溫，并以0.5 mL/min為流速;以210 nm為目標檢測波長。

2.1.2 甘草有效成分指紋圖譜色譜條件 本研究選擇Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱;流動相：乙腈-1.5%醋酸水溶液梯度洗脫，進樣體積2 μL維持和室溫相同的柱溫，并以0.8 mL/min為流速;以254 nm為目標檢測波長。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 苦杏仁苷對照品溶液制備 精密稱取12.5 mg苦杏仁苷對照品并加入50%甲醇將其定容與25 mL的容量瓶中，獲得0.503 mg/mL的苦杏仁苷對照品溶液。

2.2.2 甘草酸單銨鹽對照品溶液制備 精密稱取20 mg甘草酸單銨鹽對照品并加入40%甲醇將其定容與25 mL容量瓶中，獲得1.01 mg/mL甘草酸單銨鹽對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 苦杏仁含量測定供試品溶液制備 根據表1中麻黃湯的不同配伍方式A-H組成含苦杏仁的8個配伍組方，先根據A-H組方分別稱量麻黃湯藥材（劑量同《傷寒論》所記載），由于苦杏仁后下，先將8個組方中的其他藥物先置于含有1 000 mL水的燒瓶中浸泡30 min，加熱煮沸30 min后加熱苦杏仁，繼續加熱回流20 min，搖勻過濾即得各不同配伍麻黃湯A-H的麻黃湯水煎液;精密量取0.5 mL上述麻黃湯水煎液加入甲醇定容于25 mL量瓶，靜置2 h后離心取上清液，即得各不同配伍含苦杏仁的A-H的麻黃湯供試品溶液。

2.3.2 甘草含量測定供試品溶液制備 根據表2中麻黃湯的不同配伍方式A1-H1組成含甘草的8個配伍組方，方法同1.4.1制備各不同配伍含甘草的A1-H1的麻黃湯供試品溶液。

表1 麻黃湯不同配伍研究苦杏仁有效成分的

正交設計（1=用藥，2=不用藥）

表2 麻黃湯不同配伍研究甘草有效成分的

正交設計（1=用藥，2=不用藥）

2.4 專屬性試驗

取同一供試品溶液根據2.3制備的供試品溶液，采用薄層層析的方法對麻黃湯進行專屬性試驗，結果顯示麻黃湯專屬性良好。

2.5 線性關系考察

精密量取混合對照品的甲醇溶液3.0、6.0、12.0、18.0、24.0 mL，分別置50 mL量瓶中。加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積;以混合對照品進樣量（μg）為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結果表明，混合對照品在0.064 32～0.145 6 μg范圍內線性關系良好。

2.6 中間精密度試驗

精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續進樣5次，結果顯示相對標注偏差RSD為0.82%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩定性試驗

取麻黃湯全方的供試品溶液，分別根據苦杏仁的色譜條件和甘草的色譜條件進行指紋圖譜研究，在供試品溶液制備后0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進行測定，最終獲得苦杏仁色譜條件的RSD為1.88%;而甘草色譜條件的RSD為0.89%，表明24 h內樣品穩定以及各色譜條件的穩定性高。

2.8 重復性試驗

精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測5次，結果顯示標準偏差RSD為0.88%，重復性良好。

2.9 回收率試驗

采用加樣回收法，精密稱取5份已知含量的同一批號樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對照品甲醇溶液（0.005 36 mg/mL），進行回收率試驗測定，計算結果顯示平均回收率為98.54%，RSD為0.76%。

2.10 樣品測定結果

2.10.1 麻黃湯中苦杏仁色譜條件的指紋圖譜

如圖1所示，苦杏仁色譜條件能夠將苦杏仁苷清晰的分離出來，無論是苦杏仁苷對照品溶液、缺苦杏仁陰性對照溶液還是麻黃湯全方供試品溶液均獲得清晰的分離，無其他雜質峰，基線穩定，具有可比性。

圖1 麻黃湯中苦杏仁色譜條件的指紋圖譜

2.10.2 甘草指紋圖譜

甘草色譜條件能夠將苦杏仁苷清晰的分離出來，無論是苦杏仁苷對照品溶液、缺苦杏仁陰性對照溶液還是麻黃湯全方供試品溶液均獲得清晰的分離，無其他雜質峰，基線穩定，具有可比性。見圖2。

圖2 麻黃湯中甘草色譜條件的指紋圖譜

2.10.3 麻黃湯不同配伍方式對苦杏仁有效成分的影響

麻黃湯不同配伍方式中對苦杏仁有效成分苦杏仁苷每劑含量未見明顯差異，進行方差分析后結果顯示，麻黃湯不同配伍中麻黃、桂枝、甘草對苦杏仁苷的影響差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

圖3 麻黃湯不同配伍方式對苦杏仁有效成分的影響

表3 麻黃湯不同配伍方式對苦杏仁有效成分的影響

2.10.4 麻黃湯不同配伍方式對甘草有效成分的影響

麻黃湯不同配伍方式中以H1單純甘草中甘草酸含量為最高，而麻黃湯全方A1中的甘草酸含量為最低;不同配伍中麻黃、桂枝和苦杏仁均降低麻黃湯中甘草酸的含量（P<0.05）。見圖4和表4。

圖4 麻黃湯不同配伍方式對甘草有效成分的影響

表4 麻黃湯不同配伍方式對甘草有效成分的影響

3 討論

苦杏仁為薔薇科櫻桃屬植物山杏、薔薇科櫻桃屬植物西伯利亞杏、薔薇科櫻桃屬植物東北杏或薔薇科櫻桃屬植物杏的干燥成熟種子，苦杏仁的功效主要是止咳平喘和潤腸通便，其藥物的主要有效成分為苦杏仁苷和苦杏仁油，除了這些主要的有效藥物成分以外，苦杏仁還有多種成分，諸如苦杏仁酶、多種氨基酸類營養成分、揮發性成分和微量元素等。目前苦杏仁苷含量的測定方法繁多，采用滴定法間接測定苦杏仁苷含量的可見于中國藥典中的相關記載;隨著現代科技的發達以及中藥研究的深入，有學者采用高效液相色譜法、薄層掃描法、應用紫外吸收光譜法、化學發光法、指紋圖譜等測定苦杏仁苷的含量[9-12]。本研究基于指紋圖譜對苦杏仁中的有效成分苦杏仁苷進行測定，結果顯示，麻黃湯不同配伍方式中對苦杏仁有效成分苦杏仁苷每劑含量未見明顯差異，進行方差分析后結果顯示，麻黃湯不同配伍中麻黃、桂枝、甘草對苦杏仁苷的影響差異無統計學意義（P>0.05）。有研究顯示[13-14]麻黃湯全方配伍對苦杏仁中的苦杏仁苷有效含量沒有影響，只有麻黃與苦杏仁配伍時，其水煎液中苦杏仁苷含量亦未見增加，與本研究結果一致。

甘草為豆科植物、脹果甘草、光果甘草的干燥根及根莖，是中藥方劑中最常用的藥物之一，其功效以補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥為主，其中也因為調和諸藥這一功效而應用廣泛?，F代藥理研究證明，甘草中含有甘草酸、黃酮類和生物堿類化合物等，多種化合物各司其職發揮抗炎、抗變態反應和調節細胞免疫功能等功效。目前對甘草的用藥評價主要以其有效成分之一甘草酸的含量（定量指標），作為評價甘草的質量標準評價標準之一[15-16]。目前隨著科技的發達，甘草酸的測定方法有很多，其中以高效液相色譜法最為多見，其次毛細管電泳法和薄層掃描法等[17-18]。本研究基于指紋圖譜研究，結果顯示麻黃湯不同配伍方式中以H1單純甘草中甘草酸含量為最高，而麻黃湯全方A1中的甘草酸含量為最低;不同配伍中麻黃、桂枝和苦杏仁均降低麻黃湯中甘草酸的含量。由此推測可能甘草的有效成分甘草酸與麻黃湯中的其他三味藥材發生劇烈的化學反應，無論是有效成分之間的還是藥物毒性之間的，這些反應降低了甘草有效成分在不同麻黃湯配伍方式中甘草酸的含量，幫助甘草在麻黃湯中行使調和諸藥的功能。

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