RP—HPLC法測定淫羊藿根中朝藿定C的含量

徐作剛 段萍 萬紅才

【摘 要】 目的：建立測定淫羊藿根中朝藿定C的含量測定方法。方法：采用安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-水（25∶[KG-*3/5]75），等度洗脫，流速1mL/min，檢測波長270nm。結果：朝藿定C在0.973～9.729μg內呈良好的線性關系，r=1.0000，方法重復性、精密度等均滿足分析要求，方法回收率為102.3%，RSD為0.7%。結論：該方法測定淫羊藿根中朝藿定C的含量，結果準確，重復性、穩定性較好。

【關鍵詞】 淫羊藿根；朝藿定C；高效液相色譜；含量測定

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）16-0017-03

淫羊藿根為小檗科植物箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum （Sieb. Et Zucc.） Maxim、巫山淫羊藿Epimedium wushanenese T.S.Ying、天平山淫羊藿Epimedium myrianthum Steam、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim、氈毛淫羊藿Epimedium coactum H.R.Liang et W.M.Yan、粗毛淫羊藿Epimedium acuminatum Franch及光葉淫羊藿Epimedium sagittatum var. glabratum T.S.Ying的干燥根。具有補腎壯陽、祛風除濕的功效，用于腎虛陽痿、小便淋漓、咳喘、風濕痹痛[1]。淫羊藿含有多種有效成分，其主要有效成分為淫羊藿苷類黃酮化合物[2]，而其中的朝藿定C具有抗骨質疏松、抗癌、免疫增加等廣泛的藥理活性[3-4]。課題前期進行的預實驗結果顯示，朝藿定C的含量遠高于淫羊藿苷等其他類黃酮化合物，適宜定量分析。故選擇朝藿定C作為定量指標用于淫羊藿根藥材的質量控制。本文用反相液相色譜測定了11種貴州地產藥材淫羊藿根中朝藿定C的含量，可為淫羊藿根質量控制及相關醫藥產業提供理論根據參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國安捷倫1260高效液相色譜儀，上?？茖K250LHC超聲波清洗器，瑞士梅特勒托利多AG135和AL204電子天平，北京普析TU-1901紫外分光光度計。

1.2 材料 朝藿定C對照品（含量95.5%，批號：111780-201503，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈（色譜純，批號：20170403，天津科密歐）；95%乙醇（分析純，批號：20161105，天津科密歐）；純凈水（批號：20171201，娃哈哈）；淫羊藿根樣品分別采集自貴州各地共11批（采集信息見表1），樣品均經貴陽中醫學院何順志教授鑒定。樣品洗凈后曬干，粉碎，過三號篩，即得供試樣品，置于干燥器中保存。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[5-6] 色譜柱：美國安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-水（25∶[KG-*3/5]75）；流速：1.0mL/min，進樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測波長270nm。理論板數以朝藿定C峰計算均不低于6000。

2.2 對照品溶液配制 精密稱取朝藿定C對照品50.94mg置50mL量瓶中，加50%乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液；精密量取對照品貯備液5mL置20mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，即得（0.243mg/mL）。

2.3 供試品溶液配制[5-6] 取供試樣品約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，放置過夜，超聲60分鐘（50kHz），放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，經0.45μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 峰純度考察 取對照品溶液、供試品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項下的色譜條件，依法測定。朝藿定C峰的紫外掃描光譜表明：朝藿定C對照品的紫外掃描圖在200nm、270nm和320nm處有最大吸收。3D圖譜顯示：200nm波長處吸收大但雜質干擾較多，320nm波長處干擾少但吸收較小，270nm波長處吸收值較大且干擾少。供試品溶液中朝藿定C峰的紫外掃描圖與對照品峰的紫外掃描圖譜一致，且純度因子達到999以上。綜合以上考察，確定檢測波長為270nm。

2.5 線性關系考察 精密量取2.2項下對照品貯備液1、2、4、6、8mL分別置10mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，得一系列濃度級別的對照品溶液；精密吸取上述系列對照品溶液和對照品貯備液各10μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項下的色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，濃度（mg/mL）為橫坐標，進行線性回歸計算，朝藿定C回歸方程為：y=18219.1343x+26.8045，r=1.0000，結果表明朝藿定C在0.0973～0.9730mg范圍內呈良好的線性關系。

2.6 精密度考察 精密吸取2.2項下朝藿定C對照品溶液10μL，按2.1項下的色譜條件，注入液相色譜儀，連續進樣6次，測定峰面積，朝藿定C峰面積的RSD為0.14%，結果表明方法有良好的精密度。

2.7 穩定性考察 取同一供試品溶液分別于0、5、11、18h進樣，進樣量10μL，按2.1項下的色譜條件，測定朝藿定C峰面積，RSD為0.6%，表明供試品溶液在18h內穩定性良好。[JP]

2.8 [JP2]重復性考察 稱取同一供試品6份，按2.3項下方法配制供試品溶液，按2.1項下的色譜條件，進樣量10μL，測定峰面積，計算含量。供試品中朝藿定C的平均含量為2.611%，RSD為0.4%，表明本方法重復性良好，符合定量標準要求。[JP]

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取8份已測定含量的樣品0.1g（朝藿定C含量為2.611%），分別置具塞錐形瓶中，精密加入回收對照溶液20mL，稱定重量，放置過夜，超聲60min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續濾液，按2.1項下的色譜條件，進樣10μL，記錄色譜圖，計算回收率。朝藿定C的平均回收率為102.3%，RSD為0.7%，表明本方法準確度良好，符合相關規定。結果見表2。

2.10 樣品含量測定 取不同產地供試樣品按2.3配制供試品溶液，分別進樣10μL，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量。結果見表3。

3 討論

為獲得準確的含量測定結果，本研究考察了浸泡過夜、浸泡過夜后超聲、浸泡過夜后水浴回流、浸泡過夜后超聲再水浴回流等四種不同的提取方法，結果表明，浸泡過夜后超聲效果為最佳，增加水浴回流步驟反而使朝藿定C含量結果降低。文獻報道[7]，朝藿定C（三糖苷）在高溫環境下會脫去一個鼠李糖后轉化為淫羊藿苷（二糖苷），導致朝藿定C含量下降、淫羊藿苷含量升高。因此選擇浸泡過夜后超聲作為本實驗的提取方式。

實驗中有3個樣本分別為黔嶺淫羊藿和水城淫羊藿，不在貴州省淫羊藿根藥材標準收載的品種中，但作為貴州特有品種，本研究也對這3個樣本進行了含量測定，朝藿定C含量最低為0.86%，而標準收載的品種中，朝藿定C含量最低為0.89%。結果顯示，非標準品種中朝藿定C的含量也可以達到標準品種的含量水平，建議修訂淫羊藿根標準時增加收載品種，擴大貴州省淫羊藿根來源的覆蓋范圍。

淫羊藿根作為貴州省少數民族常用藥材，收載于《貴州省中藥材民族藥材質量標準》中，但標準中僅有一項性狀描述，不能有效控制藥材的質量。已有文獻研究對象多為淫羊藿藥材，按《中國藥典》一部定義為淫羊藿的干燥葉[8]。淫羊藿植株入藥部位不同，有效成份含量也有所差異，本研究可為淫羊藿根藥材的標準制定、醫療應用和質量控制提供數據參考。

參考文獻

[1]貴州省藥品監督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質量標準[S].貴陽：貴州科技出版社，2003：350.

[2]謝娟平，孫文基.淫羊藿屬植物化學成分及藥理研究進展[J].海峽藥學，2006，18（5）：17-20.

[3]蔡曼玲，季暉，李萍，等.5種淫羊藿黃酮類成分對體外培養成骨細胞的影響[J].中國天然藥物，2004，2（4）：235-238.

[4]Liang H R. Vuorela P. Vuorela H. et al.Isolation and immunomodulatory effect of flavonol glycosides from Epimedium hunanense [J]. Planta Medica， 1997（63）：316-319.

[5]徐文芬，楊雯，何順志，等.一測多評法測定淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定A、B、C [J].中草藥，2016，47（1）：130-137.

[6]徐文芬，何順志，黃敏，等.高效液相色譜法測定貴州產淫羊藿藥材不同藥用部位中淫羊藿苷的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2007，13（5）：1-3.

[7]孫娥，陳玲玲，賈曉斌，等.藥材品種與受熱時間對淫羊藿飲片中主要黃酮類成分的影響規律研究[J].中藥材，2012，35（9）：1402-1407.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：327.

（收稿日期：2018-06-07 編輯：程鵬飛）