電轉化條件對大腸桿菌TG1轉化效率的影響

劉 麒，王闊鵬，于凌嬌，劉倩宏

轉化是基因重組中的一項重要技術，是決定平末端連接效率及建立高質量基因文庫的關鍵。將攜帶目的基因的質粒成功導入受體細胞的方法有兩種：一種是氯化鈣法，另一種是電轉化法。電轉化法是利用瞬間高壓迫使細胞膜產生孔隙使質粒導入細胞，其轉化率較高[1]?；虻钠侥┒诉B接對轉化率要求較嚴格，需要較高的轉化率作為支撐。目前，在不同實驗室環境的影響下，感受態細胞的制備以及轉化條件都有所不同。為提高平末端連接、轉化效率，進而建立較高質量的文庫，因此本研究通過比較不同電轉化條件下大腸桿菌TG1的轉化效率，為后續噬菌體展示基因文庫的建立奠定基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與主要儀器

大腸桿菌菌株TG1本室-80 ℃保存；pDJ01質粒為梅西大學Jasna Rakonjac教授惠贈，-80 ℃保存；大腸桿菌TG1株購自廣州碧云天生物有限公司；質粒提取試劑盒購自康為世紀生物有限公司。

LB液體培養液：量取胰蛋白胨2 g，酵母提取物2.0 g，NaCl1.0 g，用去離子水定容補足體積至500 mL。

SOC培養液：在950 mL去離子水中加入胰化蛋白胨20.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl0.5 g，加入10 mL 250 mmol/L KCl溶液，用5 mol/L NaOH調pH至7.0。用去離子水定容1 L，高壓蒸汽滅菌20 min，備用。使用前加入5 mL滅菌的2 mol/L MgCl2，高壓滅菌后冷卻至60 ℃或60 ℃以下，加20 mL除菌的1 mol/L葡萄糖溶液[2]。

LB固體培養基(含20 μg/mL氯霉素)：稱取胰蛋白胨2 g，酵母提取物2 g，NaCl 1 g，瓊脂糖4 g，用去離子水定容補足體積至500 mL。待蒸汽滅菌后，將培養基放置水浴鍋中，待溫度降至40 ℃左右添加氯霉素以20 μg/mL的終濃度添加于培養基中。

TGL20M離心機、超凈工作臺、電轉儀(Bio-rad)、無菌恒溫培養箱(Thermol)。

1.2 試驗方法

1.2.1 pDJ01質粒提取 用接種環蘸取一定的菌液在新鮮的LB(含20 μg/mL氯霉素)固體培養基上交錯劃線，37 ℃ 倒置過夜培養。挑取單菌落接種于5 mL LB(含20 μg/mL氯霉素)液體培養基中37 ℃、 200 rpm/min過夜震蕩培養，將菌液離心，利用康為世紀質粒提取盒提取質粒。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質粒濃度。

1.2.2 TG1大腸桿菌生長曲線的繪制 取出-80 ℃保種的TG1大腸桿菌，用接種環蘸取一定的菌液在新鮮的LB固體培養基上交錯劃線，37 ℃過夜、靜置培養。挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養液中，37 ℃，170 rpm/min振蕩過夜培養,此即為母液。按母液與LB液體培養液1∶100比例，轉接新鮮LB液體培養液中，37 ℃，170 rpm/min振蕩培養，每隔0.5 h取菌液0.5 mL，直至培養9.5 h，取不同時間點菌液進行菌落計數，具體操作參照文獻進行，繪制TG1株大腸桿菌生長曲線圖[3-4]。

對經過培養的菌液用LB液體培養液進行10倍稀釋，稀釋成10-1～10-13，取不同稀釋度菌液100 μL涂板計數。試驗重復三次。

1.2.3 TG1感受態細胞的制備 取2 mL母液轉接到200 mL新鮮的LB液體培養液中，37 ℃、170 rpm/min振蕩培養(振蕩培養時間及條件根據1.2.2結果確定)，冰浴30 min。將冰浴后的菌液分裝至預冷的無菌離心管中，4 ℃、5 000 rpm/min離心20 min，操作始終保持在冰浴環境下進行。將上清液吸出后，再用10%無菌甘油水輕輕吹打重懸細胞，重復洗滌2次后分別用10%無菌甘油水重懸細胞沉淀。每管100 μL分裝至EP管中， -80 ℃保存備用。

1.2.4 電轉化 將2 μL pDJ01質粒加入100 μL感受態細胞中充分混合，電轉化條件為電壓1 800 V，電容25 μF，電阻200 Ω，0.1 cm電擊杯，進行電擊。立刻加入500 μ L LB保護受損細胞并轉移到離心管中，再加入400 μ L LB充分吹盡菌體加入到離心管中，37 ℃、170 rpm/min振蕩培養 45 min，用移液槍吸取100 μL涂于LB固體培養基(20 μg/mL氯霉素)，37 ℃恒溫箱過夜培養，通過生長的菌落數評價轉化效率。

1.2.5 TG1菌株在不同生長階段對電轉化效率的影響 通過1.2.2確定的對數生長期，選取活化后1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h的TG1菌液，制備感受態細胞，進行電轉化，條件同1.2.4，進行菌落計數檢測電轉化效率。

1.2.6 感受態細胞濃度對轉化率的影響 理論上感受態細胞的濃度越高其轉化率越高，但過高的濃度會使菌體過于粘稠，不利于質粒與菌體混合，反而會降低其對質粒的轉化率。按1.2.5優化的最佳條件制備感受態細胞后，將其分裝在4管50 mL預冷的無菌離心管中，每管約100 μL菌體，分別加入10%無菌甘油水進行1∶1、1∶3、1∶5、1∶7倍稀釋，以確定感受態細胞制備最佳稀釋濃度。將2 μL pDJ01質粒分別與不同稀釋倍數的感受態細胞混合，電轉化，其余操作同1.2.4。

1.2.7 轉化后復蘇時間及復蘇液對轉化率的影響 對電擊后細胞的復蘇液的選取及復蘇時間進行優化。將2 μL pDJ01質粒與100 μL感受態細胞混合，進行電轉化操作同1.2.4，電擊后立即加入900 μ L LB液體培養液和SOC培養液，37 ℃、170 rpm/min振蕩培養 ，分別在0.75 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h四個時間點取樣。取不同復蘇液及不同復蘇時間的菌液樣本50 μL進行涂板，恒溫箱37 ℃倒置過夜培養，進行菌落計數。其余操作同1.2.4。

圖1 圖1. pDJ01質粒提取結果1.提取質粒pDJ01結果；2.10000mark(條帶大小從下到上分別為100 bp.250 bp.500 bp.750 bp.1 000 bp.1 500 bp.2 000 bp.3 000 bp.5 000 bp.10 000 bp)

1.2.8 電轉化條件對轉化率的影響 選用以下三組不同條件進行電轉化：電壓1 800 V、電容25 μF、電阻200 Ω 、0.1 cm電擊杯；電壓2 500 V、電容25 μF、電阻200 Ω 、0.1 cm電擊杯；電壓3 000 V、電容25 μF、電阻200 Ω 、0.2 cm電擊杯。電轉化后操作與1.2.4相同，培養后進行觀察。

1.2.9 質粒濃度改變對轉化率的影響 分別取100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL不同濃度的pDJ01質粒2 μL與100 μL感受態細胞充分混合，冰浴靜置5 min進行電轉化，操作與1.2.4相同，根據結果評價質粒濃度改變對轉化率的影響。

1.2.10 抗生素濃度對轉化率的影響 向LB固體培養基中添加氯霉素使其濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL。利用1.2.8優化的電轉化參數對其進行電轉化操作后，分別將其涂布于氯霉素濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的LB固體培養基上。其余操作同1.2.4，根據結果評價抗生素對轉化效率的影響。

2 結果

2.1 pDJ01質粒提取結果

pDJ01質粒提取結果見圖1。pDJ01質粒大小約為1 500 bp，在預期位置發現目的條帶，并估算其濃度約為100 ng/μL。

2.2 大腸桿菌TG1生長曲線的繪制

分別取活化后不同時間點TG1菌液，繪制細菌生長曲線，結果見圖2。從圖中可看出， 1.5 h至5 h TG1處于對數生長期。細菌處于對數生長期時的形態、染色特性、致病性、抗藥性等生物特征最為典型，TG1生長曲線的繪制對于后續系列轉化條件的優化至關重要。

圖2 大腸桿菌TG1生長曲線

圖3 TG1菌株在不同生長階段對轉化率的影響

圖4 細胞濃度對轉化率的影響

圖5 TG1轉化時間及復蘇液對轉化率影響結果

圖6 電轉化條件對轉化率的影響

2.3 TG1菌株在不同生長階段對電轉化率的影響

分別取活化后1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h的大腸桿菌TG1菌液制備感受態細胞，電轉化，進行菌落計數，結果見圖3，經統計學分析，各組間差異極顯著(p<0.01)，因此在活化后3.0 h時，其電轉化效率最高。

2.4 感受態細胞濃度對轉化率的影響

取活化后3.0 h菌液制備感受態細胞，以10%無菌甘油水稀釋制備好的感受態細胞，電轉化后確定不同感受態細胞濃度對轉化效率的影響，結果見圖4。經統計學分析，1組(1∶1倍稀釋)、2組(1∶3倍稀釋)、3組(1∶5倍稀釋)之間結果無顯著差異(p>0.05), 1組、2組、3組與4組(1∶7倍稀釋)之間結果差異極顯著(p<0.01)，試驗以1∶1倍稀釋濃度為最佳操作條件。

2.5 電轉化后復蘇培養液及復蘇時間對轉化率的影響

選用LB和SOC不同復蘇液對電擊后感受態細胞進行復蘇，結果見圖5。用LB復蘇液復蘇電擊后細胞效果明顯優于SOC復蘇液，經統計學分析，差異極顯著(p<0.01)。

選取LB復蘇液后分別搖動0.75 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后，從圖5看出并經統計學分析，不同復蘇時間對轉化效率沒有影響。經統計學分析，差異不顯著(p>0.05)，因此試驗選用電擊后復蘇0.75 h。

選取SOC復蘇液后分別搖動0.75 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后，從圖5看出并經統計學分析，差異不顯著(p>0.05)，不同復蘇時間對轉化效率沒有影響。因此試驗選用電擊后復蘇0.75 h。

2.6 電轉化條件對轉化率的影響

分別設定三組不同電擊參數及不同厚度電擊杯，確定其對轉化效率影響，結果見圖6。從圖中可以看出第1組即電壓1 800 V，電容25 μF，電阻200 Ω，電轉化效率最高，并經統計學分析，1組與2組、3組間差異極顯著(p<0.01)，為最佳電轉化參數。

2.7 質粒濃度的改變對轉化率的影響

選取100 ng/mL、 50 ng/mL、25 ng/mL不同濃度的pDJ01質粒2 μL與100 μL感受態細胞充分混合后，從圖7看出100 ng/mL pDJ01質粒轉化效率最佳，經統計學分析，1組與2組、3組間差異極顯著(p<0.01)，為最佳質粒濃度。

2.8 抗生素濃度對轉化率的影響

向LB固體培養基中分別添加10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL濃度的氯霉素，從而確定不同濃度抗生素對轉化效率的影響。結果見圖8，抗生素濃度為20 μg/mL時轉化率最高，恰好適宜轉化后的細胞增殖并抑制雜菌生長，經統計學分析，1組與2組、3組間差異極顯著(p<0.01)，在氯霉素含量為20 μg/mL的條件下，轉化效率最高。

圖7 質粒濃度的改變對轉化率的影響

圖8 抗生素濃度對轉化率的影響

3 討 論

感受態細胞的制備和轉化已經成為分子生物學實驗中的一項常規操作，常見轉化方法包括電轉化法、MgCl2-DMSO法、LiAc和 CaCl2法等，而電轉化法相對成本較低、操作簡單、轉化效率較為理想，轉化條件因實驗室不同，結果也不盡一致，而且不同的菌株對電轉化的反映程度不同，所用的轉化效率和轉化條件一定不同[5-8]。研究對大腸桿菌TG1轉化條件進行了探索，為后續平端連接以及建庫打下良好的基礎。

電壓是決定電轉化效率的重要參數，通過運用高電壓將細胞的細胞壁電擊出可以使大分子物質通過的小孔。由于利用強電壓對細胞進行電擊將會對細胞造成極大的損傷，在此過程中會使較多的細胞受損死亡以及生存受限而難以得到高轉化率，并且死亡的菌體會嚴重影響細菌的生存空間從而限制其生長。因此，嚴格選擇適宜的電壓是進行電轉化試驗時，達到預期效果和必需條件的重點。經過試驗摸索最適電壓為1 800 V，此電壓電擊轉化率最好。

研究對SOC、LB兩種復蘇液的效果也進行了比較。SOC復蘇液營養物質含量較LB更加豐富，但其對電擊后細菌的生長并沒有明顯促進作用，即使在復蘇過程中，菌體沉淀量遠多于LB復蘇液，事實上并沒有在轉化率上體現出來，分析其原因可能是因為SOC復蘇液豐富的營養，相對而言只加速了未受損細胞的生長速度，而對轉化率則沒有明顯促進作用[9]。這與黃學娟,張金迪,張壯等人的研究不符，其原因可能是由于試驗條件與環境不同而造成的差異。

4 結 論

在本實驗室條件下大腸桿菌TG1株感受態細胞最優制備條件為：TG1大腸桿菌母液按照1∶100導入新鮮LB液體培養液后， 37 ℃、170 rpm/min活化培養3 h，感受態終濃度1.4×107，復蘇液選用LB液體培養液，復蘇時間為3.0 h；最佳電轉化條件:為電壓1 800 V，電容25 μF，電阻200 Ω，pDJ01質粒濃度為100 ng/μL，氯霉素濃度20 μg/mL。