棗花及棗花蜜香氣成分分析

敖常偉，呂 姍，吳香菊，趙智慧，劉孟軍,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.河北農業大學中國棗研究中心，河北 保定 071000）

棗屬（Ziziphus Mill）是鼠李科（Rhamnaceae）植物50多個屬中經濟價值最高的一個屬[1]。我國的棗樹大致分布在東經76°～124°、北緯23°～42°范圍內，是我國分布最為廣泛的果樹品種之一，也是我國的優勢樹種，其產量（占世界99%）位居干果產量中的第1位[2]。棗樹五月開花，花期一直延續到七月，花量大，泌蜜豐富，是北方主要的蜜源植物[3]，棗花呈黃綠色，個體較小，花中有蜜盤，花蜜在蜜盤上積聚成滴，晶瑩如珠，香氣濃郁，氣味獨特，是典型的蟲媒花。蜜蜂采集棗花蜜盤中的花蜜，與自身分泌物結合后經轉化、脫水，在蜂巢中釀造成熟后形成天然甜味物質即為棗花蜜，具有特有的棗花香氣[4]。前人關于棗花香氣成分的研究多集中于沙棗花，丁佳雯等[5]采用水蒸氣蒸餾法、固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）法、頂空采集法和氣囊采集法提取并鑒定了沙棗花的揮發性成分。楊虎等[6]采用超臨界CO2萃取法萃取了沙棗花精油并對其進行了分析鑒定；有關沙棗花的系列研究還有很多，但沙棗花是棗花中的特殊品種，并不具有代表性。另外本課題組成員也曾經對選取的不同品種棗花的香味成分進行了分析鑒定，盧愿[7]對贊皇大棗、金絲小棗、冬棗3 個品種的棗花揮發性成分進行探究；陳奇奇[8]選取了9 個具有代表性的棗花品種，采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對其揮發性成分進行了分析鑒定；但由于當時實驗方法和儀器設備的限制條件，對棗花揮發性物質的提取以及成分的鑒定方法研究不夠深入，多局限于對揮發性成分的籠統定性，并未與嗅覺分析相結合，缺乏對棗花香味物質進行系統性的研究。同時，鮮見國外研究學者關于棗花香氣成分的研究報道。另外當前市面銷售的棗花蜜種類很多，但目前缺乏能準確快速鑒定是否真的來源于棗花的方法，如果能建立棗花與棗花蜜香味成分的聯系，對今后建立準確判別棗花蜜真假的鑒定方法將具有重要意義。

SPME是集采集、富集濃縮、進樣于一體的無溶劑的樣品前處理方法，通常與GC、GC-MS、液相色譜、液相色譜-質譜等儀器聯用[9]。氣相色譜-質譜-嗅覺（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）法是將GC的分離能力與人靈敏的嗅覺結合起來對香味活性成分進行鑒定，可以彌補單獨MS鑒定的不足[10-11]。當前相關學者采用SPME結合GC-MS聯用技術對植物中各種揮發性成分的分離和鑒定進行了大量研究。謝超等[12]采用頂空SPME結合GC-MS對3 個不同品種的櫻桃香氣成分進行分析鑒定，發現酸類和酮類物質隨著果實不斷成熟含量逐漸增加，烴類物質含量不斷下降，乙醇含量上升，而（Z）-2-己烯醇含量逐漸下降。王長鋒[13]采用GC-MS分析貯藏溫度對紅肉臍橙果皮香氣成分的影響，結果表明貯藏溫度對α-蒎烯、β-水芹烯、正辛醇的生成和降解影響明顯，還會改變辛醛與橙花醇的生成與降解途徑。González-Cebrino等[14]采用頂空SPME法研究了高壓處理對梅子香氣成分的影響。Riu-Aumatell等[15]采用GC-MS-O法研究了幾種果汁的香氣成分，發現該方法可以快速有效地區分調配果汁與天然果汁。賈媛等[16]采用GC-MS聯用儀對香茅精油化學成分進行分析鑒定，共分離出29 種組分。羅靜等[17]采用頂空SPME法提取4 個品種的桃成熟果肉中的揮發性成分，并用GC-MS聯用儀對其進行測定，4 份桃種質中共鑒定出116 種揮發性成分，明確了桃香味物質的主要構成成分。楊秀蓮等[18]采用頂空SPME結合GC-MS技術對3 個四季桂品種盛花期花瓣的揮發性化學成分進行了分析，并比較了鮮花與短期超低溫冰箱保存后花瓣揮發性成分的差異，結果表明，不同四季桂品種的香味主體成分比較接近，主要成分為β-紫羅蘭酮、二氫-β-紫羅蘭酮、順-芳樟醇氧化物（呋喃型）等物質。類似研究較多，這也說明利用現代儀器分析鑒定手段對植物的花香成分進行研究是當前國內外的發展趨勢。

本研究選擇頂空SPME結合GC-MS-O法，以常見婆棗的棗花為分析對象，比較不同階段棗花的香氣成分差異，棗花與棗花蜜香氣成分的關聯，旨在充分了解棗花及棗花蜜的香氣成分的組成及變化，為今后開發類似棗花香精提供理論依據，另外也為市面上真假棗花蜜的鑒定提供技術參考。同時，建立一套系統的棗花香氣成分提取、分離、定性和定量的方法，為今后棗的利用及棗相關產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棗花原料采摘于河北省保定市河北農業大學棗標本園的婆棗，棗花蜜購于河北農業大學棗標本園內放蜂的蜂農，確保該蜂蜜來源于棗花。

C5～C30正構烷烴標準品 美國Accustandard公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A型GC-MS聯用儀、HP-Innowax毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；ODP3型嗅聞儀 德國Gerstle公司；85-2A磁力加熱攪拌器 常州朗越儀器制造有限公司；SPME手動進樣手柄 美國Supelco公司；20 mL螺口頂空瓶（含PTFE硅膠墊和螺紋金屬蓋） 杰島生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香氣成分的萃取

采取頂空SPME法對棗花揮發性成分進行萃取。將裝有樣品的頂空瓶置于40 ℃水浴中預熱平衡10 min。然后將活化好的萃取頭插入20 mL樣品瓶（活化條件根據萃取頭的不同嚴格按照萃取頭附帶的活化指南進行），溫度40 ℃，萃取時間40 min，進樣口溫度240 ℃，解吸時間8 min。為使SPME所得到的揮發性組分更具代表性，考察4 種常用的SPME纖維頭[11-12]：50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS，樣品添加量（1、2、3、4 g），萃取溫度（30、40、50、60 ℃），萃取時間（30、40、50、60 min），解吸時間（2、4、6、8、10 min）5 個影響因素，評價指標為總峰面積和數量，平行處理3 次。

參考任佳淼[19]對棗花蜜進行前處理及萃取。棗花蜜20 g，加入0.7 mL去離子水和0.4 g NaCl，混勻，密封。采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS于70 ℃萃取50 min。

1.3.2 GC條件

色譜柱：HP-Innowax毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持1 min，以7 ℃/min升至250 ℃，保持13 min；載氣（He）流速1.45 mL/min；進樣口溫度240 ℃；不分流。

1.3.3 MS條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；采集類型：全掃描；質量掃描范圍m/z 33～350；輔助加熱器溫度250 ℃。

1.3.4 嗅聞儀條件

輔助氣N2，傳輸線溫度250 ℃。實驗時選擇3 人對樣品進行嗅聞分析，同一種物質被2 人以上嗅聞到并且有相似嗅覺描述時，其結果可被計入最終數據分析。通過預實驗結果分析，選擇4 種氣味明顯的化合物，分別為醋酸、正己酸、糠醛、5-羥甲基糠醛，將這4 種化合物標準品用二氯甲烷分別釋至50、100、500、1 000 μg/mL，嗅聞人員應事先以這4 種標準品進行嗅聞訓練，記錄聞到氣味的時間，嗅聞時間比保留時間大約滯后0.1 min，并通過訓練熟悉掌握嗅聞儀的使用。

1.3.5 定性及定量分析

各組分與NIST 14標準譜庫進行對照分析，匹配度不小于80%的計入結果，保留指數（retention index，RI）根據相同色譜條件下C5～C30正構烷烴標準品對各組分的保留時間進行計算，用匹配度及RI定性，采用峰面積歸一法計算各組分相對含量。

2 結果與分析

2.1 SPME條件優化

2.1.1 萃取頭的選擇

不同萃取纖維表面涂漬有不同性質的固定相涂層，這些固定相涂層對不同化合物具有一定的富集效果，萃取纖維涂層是影響萃取選擇性和靈敏度的關鍵因素[20]。如圖1所示，比較4 種類型的萃取纖維對棗花揮發性成分的萃取效果（以總峰面積評價吸附量，總峰數量評價化合物種類）。4 種不同萃取纖維[21-22]所得揮發性成分的總峰面積及數量均存在顯著性差異。其中50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取效果最好（化合物數量及總峰面積最大），綜合考慮選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維。

圖1 萃取纖維類型對SPME效果的影響Fig. 1 Effect of fi ber types on the extraction efficiency of SPME

2.1.2 樣品添加量的選擇

圖2 樣品添加量對SPME效果的影響Fig. 2 Effect of sample amounts on the extraction efficiency of SPME

頂空體積是影響待測物吸附量的重要因素，棗花體積不易測定，因此可以通過調節棗花添加量來控制頂空體積。如圖2所示，峰面積隨樣品添加量的增加而增加，當樣品添加量超過2 g時，所得揮發性成分種類并無顯著性增加，當樣品添加量達到4 g時，揮發性物質種類減少，可能是頂空體積較小導致的。樣品添加量超過3 g時，吸附量達到平衡。樣品添加量過多會減小頂空體積，操作時萃取纖維暴露于頂空部分，且萃取纖維具有一定長度，體積過小不僅不利于香氣成分的揮發，還會使樣品接觸萃取頭，引起萃取頭污染，也會增加操作難度。因此，添加3 g棗花較合適。

2.1.3 萃取溫度的選擇

如圖3所示，萃取溫度為30、40、50 ℃時對揮發性物質種類影響不顯著，但60 ℃與之相比差異顯著，40、50、60 ℃時揮發物質吸附量差異不顯著，但與30 ℃相比差異顯著，升高萃取溫度可以提高揮發性物質在頂空體積中的濃度，促進萃取達到動態平衡，但過高溫度容易導致棗花香氣失真，綜合考慮， 40 ℃萃取平衡較為合適。

圖3 萃取溫度對SPME效果的影響Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of SPME

2.1.4 萃取時間的選擇

圖4 萃取時間對SPME效果的影響Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction efficiency of SPME

如圖4所示，萃取所得化合物種類和吸附量隨時間延長呈上升趨勢。在萃取的初始階段吸附量增加迅速，直至達到平衡，而繼續延長萃取時間吸附量和種類不再有明顯的變化吸附纖維達到平衡。萃取30 min與40 min所得總峰面積并無顯著性差異，萃取50 min與30、40 min相比吸附量顯著增加。說明適當延長萃取時間有助于富集較多的揮發性物質，但由于棗花為鮮樣，長時間保持加熱狀態容易萎蔫，使香氣失真。綜合考慮，萃取50 min較為適宜。

2.1.5 解吸時間的選擇

圖5 解吸時間對解吸效果的影響Fig. 5 Effect of desorption time on the desorption efficiency

實驗過程中發現解吸時間對吸附量和種類影響較為顯著，一方面，解吸時間不足使解吸不徹底，從而導致物質在萃取纖維表面的殘留，使檢測結果不具代表性，甚至污染后續樣品，另一方面，萃取纖維長時間處于高溫解吸狀態會加速萃取纖維失效時間，縮短壽命。如圖5所示，不同解吸時間所得揮發性物質的總峰面積和數量存在顯著性差異，吸附量和種類隨解吸時間的延長而增加，解吸時間延長至8 min和10 min時，吸附量及種類變化無顯著性差異，因此，選擇8 min作為最佳解吸時間。

2.2 開花階段棗花揮發性成分的GC-MS-O分析

表1 開花階段棗花香氣GC-MS-O分析結果Table 1 Results of GC-MS-O analysis of aroma components of jujube fl owers at different maturity stages

續表1

對3 個花期（花蕾期、盛花期、末花期）的棗花香氣成分進行分析、鑒定與比較，主要揮發性化學物的鑒定結果見表1和圖6。其中花蕾期的棗花還未開放，盛花期棗花中蜜盤呈嫩黃色，富含新鮮花蜜，末花期棗花中蜜盤呈淡綠色，花蜜量少或幾乎不含蜜。采用頂空SPME結合GC-MS-O對3 個不同花期的棗花揮發性成分鑒定，如表1所示?；ɡ倨跈z測出59 種成分，其中包括酯類22 種、烯烴類19 種、醇類7 種、酸類5 種、酮類物質2 種，這59 種揮發性物質中經GC-O鑒定出38 種香氣活性成分，α-羅勒烯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、3-己烯醇乙酯、（E）-2-甲基-2-丁烯酸乙酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯為構成花蕾香氣的主要成分。盛花期的棗花中共鑒定出59 種揮發性成分，包括酯類24 種、烯烴類13 種、醇類6 種、酸類4 種、醚類物質3 種、酮類5 種，這59 種揮發性物質中經GC-O鑒定出30 種香氣活性成分，4-甲基-戊酸乙酯、苯甲酸乙酯、α-羅勒烯、2-甲基丁酸乙酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯為構成盛花期棗花香氣的主要成分。末花期檢測出55 種成分，其中包括酯類16 種、烯烴類13 種、醇類4 種、酸類8 種、醚類3 種、酮類4 種，這55 種揮發性成分中經GC-O鑒定出26 種香氣活性成分，2-甲基丁酸乙酯、4-甲基-戊酸乙酯、月桂酸甲酯、α-羅勒烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯、2-甲基-環丁酮為構成末花期棗花香氣的主要成分。

構成棗花揮發性成分的物質中酯類物質種類最多，是棗花香氣的主要來源。多數酯類物質可以賦予植物果香味，2-甲基丁酸乙酯是棗花主要的酯類成分，有類似于草莓、青草、蘋果的氣味。酯類物質在棗花盛花期最多，末花期逐漸減少，與末花期相比，盛花期特有的酯類成分為（E）-2-甲基-2-丁烯酸乙酯、丁酸乙酯、（Z）-4-辛烯酸乙酯、十一酸乙酯、苯甲酸甲酯、水楊酸乙酯、十三烷酸乙酯、丁位癸內酯、棕櫚酸乙酯，其中丁酸乙酯、（E）-2-甲基-2-丁烯酸乙酯具有果香味，末花期中這些酯類物質消失，這也是末花期棗花失香的原因之一。相對于其他2 個時期，花蕾期特有的酯類成分是異戊酸乙酯、（Z）-3-甲基丁酸-3-己烯酯、2-丁烯酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基丁酸己酯、辛酸乙酯、水楊酸甲酯、（Z）-肉桂酸乙酯，其中異戊酸乙酯、辛酸乙酯、水楊酸甲酯具有果香或花香味，2-丁烯酸乙酯具有微酸味，這是造成棗花蕾與成花香氣成分差異的原因之一。

烯烴類物質中（4E,6Z）-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯、α-羅勒烯、α-法尼烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯為主要成分，α-羅勒烯與α-法尼烯具有花香氣味，4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯具有清香味，是構成棗花香味的主要物質，α-羅勒烯和α-法尼烯從花蕾期到末花期相對含量逐漸升高，α-羅勒烯也是影響玉簪花香氣的主要成分[23]。2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、月桂烯、2,4-二甲基苯乙烯、β-可巴烯、畢澄茄烯、檸檬烯只存在于花蕾中。

醇類物質也是香氣的來源之一，（E）-3-己烯-1-醇在花蕾中相對含量較高，盛花期較低，但到了末花期未檢出，具有典型青草味、酸味，也是板栗花的主要香氣成分[24]；葉醇也存在于花蕾期和盛花期，具有酸味，末花期葉醇未檢出；芳樟醇與橙花叔醇僅存在于花蕾中，橙花叔醇也存在于丁香花中，芳樟醇具有花香味[25-26]。

酸類物質在末花期時相對含量均有所增加，如正辛酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸是末花期棗花獨有的揮發性成分，肉豆蔻酸可作為增香劑，酸類物質釋放特殊的酸味或者青草味，在棗花中乙酸、4-甲基-3-戊烯酸、正己酸和壬酸具有典型的酸味或青草氣味。

醚類物質主要存在于盛花期和花末期的棗花中，有苯甲醚、2-甲基苯甲醚、對甲苯甲醚。苯甲醚和2-甲基苯甲醚具有花香味，對甲苯甲醚具有清香味。醚類物質只存在于開放后的棗花中，說明醚類物質只在開花后釋放，苯甲醚可用于香料的合成，也存在于天然山茶花精油中[27-28]。酮類物質在花蕾中較少，而在盛花期棗花中種類較多。酮類物質也是典型的芳香性成分[29]，棗花中典型的有2-甲基-環丁酮與鄰氨基苯乙酮，2-甲基-環丁酮在末花期相對含量明顯增加，具有較淡的花香味，鄰氨基苯乙酮只存在于盛花期的棗花中。

圖6 棗花不同開花階段香氣成分總離子流圖Fig. 6 Total ion current chromatograms of jujube fl owers at different maturity stages

2.3 棗花蜜揮發性成分的GC-MS-O分析

表2 棗花蜜香氣成分GC-MS-O分析結果Table 2 Results of GC-MS-O analysis of aroma components of jujube honey

續表2

如表2所示，棗花蜜中共檢測到65 種揮發性成分，其中包括醇類14 種、酸類12 種、醛類10 種、烷烴7 種、酮類5 種、萜烯類4 種、酚類4 種、酯類2 種，這65 種揮發性物質中經GC-O鑒定出27 種香氣活性成分，3,7-二甲基-1,5,7-辛三醇、壬醛、苯乙醛、芳樟醇、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇為構成棗花蜜香氣的主要成分。壬醛、苯乙醛、芳樟醇在裴高璞[30]、孫雨安[31]等研究中也被鑒定為棗花蜂蜜的特征香氣成分。

蜂蜜是花蜜經蜜蜂采集后貯存于蜂巢中，經過充分釀造而成的，不僅具有特有的釀造風味，還具有特殊的花香味，醇類、醛類、酸類物質為構成棗花蜂蜜香氣的主要成分，占總揮發性成分的85.67%，與申永波等[32]檢測結果一致。而棗花中酯類物質與烯烴類物質較多，以盛花期棗花為例，酯類與烯烴類物質占總揮發性成分的90.53%。棗花蜜中僅檢測到2 種酯類物質，且相對含量較低。酯類與烯烴類物質僅占6.6%，說明棗花香氣中的特征酯類成分并不是棗花蜜中的特征香氣成分。醛類物質在棗花蜜中占29.64%，但并未在棗花中檢測到，同時棗花蜜中醇類物質種類遠多于棗花中的醇類物質，說明醛類及醇類可能是在蜂蜜釀造過程中產生的一類物質，賦予蜂蜜釀造風味。

2.4 棗花及棗花蜜香氣成分分析

如表3所示，選擇棗花的共有成分時，因為棗花的3 個不同開花期的香味物質有所變化，所以選擇含有較高香味成分的花期。共有成分有月桂酸、芳樟醇、（E）-3-己烯-1-醇、肉豆蔻酸、異辛醇、乙酸、正己酸、正辛酸、壬酸、棕櫚酸、2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、苯酚、水楊酸甲酯、甲氧基苯基-肟、萘、3-氰基吡啶、苯甲醇，這些共有成分相對含量差異較大。芳樟醇和壬酸是棗花蜜中相對含量較高的2 種物質，而其他成分不管在棗花還是棗花蜜中相對含量都不高。其中2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、（E）-3-己烯-1-醇、壬酸具有青草氣味，芳樟醇、苯甲醇、月桂酸、水楊酸甲酯、萘具有花香味及清香味，乙酸、正己酸具有典型的酸味。這些共有成分是棗花蜜具有濃郁棗花香氣的主要原因。

表3 棗花及棗花蜜共有香氣成分及相對含量Table 3 Aroma components and their relative contents detected in both jujube fl owers and honey

3 結 論

對棗花香氣成分的萃取采用頂空SPME法，棗花香氣最佳萃取條件：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、樣品添加量3 g、萃取溫度40 ℃、萃取時間50 min。在此條件下將萃取纖維在進樣口解吸8 min。采用GC-MS-O法對不同花期階段的棗花進行鑒定和分析，共檢測出84 種成分，其中38 種經GC-O聞香后鑒定為香氣活性成分。異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、（E）-2-甲基-2-丁烯酸乙酯、3-己烯醇乙酯、α-羅勒烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯為構成花蕾香氣的主要成分。2-甲基丁酸乙酯、4-甲基-戊酸乙酯、α-羅勒烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯、苯甲酸乙酯為構成盛花期棗花香氣的主要成分。2-甲基丁酸乙酯、4-甲基-戊酸乙酯、α-羅勒烯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、α-法尼烯、月桂酸甲酯、2-甲基-環丁酮為構成末花期棗花香氣的主要成分。棗花蜜中共檢測到65 種揮發性成分，其中27 種經GC-O聞香后鑒定為香氣活性成分。3,7-二甲基-1,5,7-辛三醇、壬醛、苯乙醛、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇、芳樟醇為構成棗花蜜香氣的主要成分。棗花與棗花蜜共有的香氣成分為（E）-3-己烯-1-醇、異辛醇、芳樟醇、苯甲醇、乙酸、正己酸、正辛酸、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、苯酚、水楊酸甲酯、甲氧基苯基-肟、萘、3-氰基吡啶。以上共有成分是棗花蜜具有濃郁棗花香氣的主要原因。