川渝地區膽腑郁熱型鼻淵患者鼻腔分泌物含量與證候研究*

竇豆 謝慧 張鋒 李玲瓏

慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhino-sinusitis，CRS）是由致病菌引起的鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎癥，是耳鼻咽喉科常見的慢性感染性疾病之一，是宿主和環境多因素相互作用的結果。研究證實鼻竇炎的反復發作以及難治愈性與鼻-鼻竇細菌生物膜形成有關[1，2]。鼻腔菌群通過相互影響，作用形成生物膜，加大了鼻竇炎的治愈難度，在此過程的調控機制中，目前許多微生物研究表明密度感應系統(quorum sensing)，是微生物群體信息傳遞的機制，細菌間通過分泌化學信號分子自誘導物(autoindueer，AI)調控菌屬種群密度及結構基因表達，進而引起生理行為改變[3，4]。鼻腔中存在桿菌，球菌，革蘭陰性菌及陽性菌等各種細菌，為形成生物膜提供條件，使得慢性疾病遷延難愈。

為探討CRS患者鼻腔中細菌表達情況，使用鼻腔分泌物離體分離培養技術，結合雙抗體夾心酶聯免疫法檢測膽腑郁熱型鼻淵患者鼻腔菌群及竇口鼻道復合體分泌SigA與正常人之間的差異，通過統計學分析，正常人與患者之間差異性，為臨床實踐提供思路，為細菌生物膜的研究進行鋪墊，現具體報告如下。

資料與方法

1 病例收集

選取2015年11月～2016年5月期間重慶市永川區中醫院及成都中醫藥大學附屬醫院耳鼻咽喉科門診符合西醫慢性鼻-鼻竇炎診斷標準[5]（2012，昆明）以及根據中國中醫藥出版社2012年出版的“十二五規劃教材”《中醫耳鼻咽喉科學》[6]中膽腑郁熱證的辨證診斷標準，中醫證候量化評分在5～9分之間，未行手術治療，近2月未使用抗生素、糖皮質激素口服及噴鼻劑治療，性別不限，年齡在18～60歲之間，自愿受試患者。

2 取樣及實驗方法

嚴格按照技術操作規范，充分消毒內窺鏡，帶無菌手套，以無菌棉拭子置于受檢者的中鼻甲下外側即中鼻道，旋轉2周半擦取黏膜表面菌群，整個取樣過程避免接觸鼻腔側壁及鼻前庭。采得樣本置于3mL塑料EP管中，管內含有1.5ml還原性硫乙醇酸鹽轉運液。轉移樣本于4℃保存不超過24小時，于成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科進行細菌培養及優勢細菌鑒定。

3 ELISA標本備制及試驗

將裝有原始樣本的離心管置于震蕩機1min，使棉拭子上的細菌脫落于轉運液中，后丟棄棉拭子。再將離心管置于高速離心機中，8000rpm，10min后，用移液槍吸取上清液140ul，-40℃凍存。用于ELISA法檢測取竇口鼻道復合處黏膜分泌物生物酶SigA含量，每個標本制作3個附孔，取平均值進行統計。

4 觀察指標

4.1 細菌鑒定

使用血平板進行細菌培養，培養72小時后挑取單一菌落進行優勢菌種鑒定，使用法國生物梅里埃全自動微生物鑒定系統（型號VITEK2compact）鑒定優勢菌。

4.2 使用，ELISA試劑盒（南京建成，人分泌型SIgA）檢測鼻腔黏膜分泌物SigA濃度，在全波長酶標儀（Thermo Fisher）450mm 檢測。

結果

1 進行病例證型分析統計時發現，成都地區膽腑郁熱型鼻淵納入患者約占鼻淵患者就診人數25.3%，永川地區膽腑郁熱型鼻淵納入患者約占鼻淵患者就診人數22.5%。

2 根據ELISA標準曲線計算出每個樣本OD值對應濃度。通過線性式及多項式方法計算標準曲線計算發現R=0.999＞0.99,實驗精確誤差小，可用于統計。ELISA標準曲線如圖1。

圖1 ELISA標準曲線

3使用SPASS 17.0進行數據分析，發現研究數據符合正態分布，且方差齊，使用t檢驗，發現鼻淵患者與正常人鼻腔分泌物SigA濃度，存在顯著差異（t=3.863，P=0.003＜0.05），具有統計學意義。

4 不同地區（成都和重慶永川區）CRS患者之間鼻腔分泌物SigA含量，經過統計學分析P＞0.05），無統計學差異。不同地區正常人鼻腔分泌物SigA含量之間，P＞0.05，差異無統計學意義，如表1。

表1 慢性鼻竇炎患者與正常人鼻腔分泌物SigA含量對比

討論

1 川渝地區患者與正常人，鼻腔分泌物SigA含量差異無統計學意義。不同地區人群鼻腔與外界相通雖然受空氣，粉塵，污染物等大氣因素的影響，但對鼻腔黏膜細菌分泌物的影響可以忽略不計，且取樣時間涉及一年四季，從另一個方面證實至少在成都及重慶地區，外界環境對于鼻腔微環境的影響可以忽略不計，可以推廣使用同一種安全有效的治療方案。南北方差異，以及長江流域，黃河流域差異問題有待進一步大樣本研究。

2 成都及重慶永川地區慢性鼻-鼻竇炎患者與正常人鼻腔黏膜分泌物SigA差異具有顯著統計學意義。在實驗過程中發現，取鼻腔菌群進行離體培養與鑒定時發現，鼻竇炎患者鼻腔菌群生長更快，菌群種類相對于正常人而言更多樣化，60小時就可鋪滿直徑為10mm血平板。通過微生物細菌鑒定，發現兩個地區鼻竇炎患者中約3%為鏈球菌，4%肺炎球菌及巴氏葡萄球，6%類白喉棒狀桿菌，12%為金黃色葡萄球菌，61.1%為表皮葡萄球菌，細菌種屬過少無法確切鑒定出菌種約占9.8%；正常人中約65%為表皮葡萄球菌，30%為金黃色葡萄球菌。鼻腔菌群與正常人對比而言，菌種類繁多，菌落生長較快。

3 納入慢性鼻竇炎患者時使用，鼻淵膽腑郁熱證中醫標準證候評分，發現患者平均評分為6.5分（患者平均年齡36.5歲，男32例，女40例），評分越高則鼻腔內SigA濃度越高，說明鼻腔菌群的多少，細菌對于鼻黏膜的影響與患者病情呈正相關。

4 通過預實驗及正式實驗，綜合各類減少實驗誤差的方法[7]，探究發現SigA濃度與細菌濃度有關，與分泌物量無關。此項結論可以解釋，鼻腔大小與形成病理疾病關系甚小，疾病形成多與鼻腔結構有關。

對鼻淵患者鼻腔細菌菌種及黏膜分泌物SigA含量的研究，為研究鼻腔細菌生物膜做鋪墊，治療膽腑郁熱型鼻淵中成藥鼻淵舒口服液，在對抗細菌生物膜上存在一定優勢，通過后期研究，進一步論治細菌生物膜[8]在慢性鼻竇炎中的病理機制，詳細研究生物膜群里感應型號AI-2在鼻竇炎患者中的表達情況，研究中藥制劑對抗生物膜機制，更有效地發揮中醫中藥的優勢作用。