FGF-21和Nrf2對博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化的影響*

周 淼， 李風雷， 孫俊波

(1河南中醫藥大學第三附屬醫院肺病科， 河南 鄭州 450000； 2河南省中醫院， 河南 鄭州 450002)

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是過多的纖維膠原沉積在肺間質內的一種慢性進行性疾病，其主要特征表現為炎癥細胞因子的積累，成纖維細胞過度增殖和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的大量沉積等，其發病過程和機制尚不明確。近年來大量研究表明氧化與抗氧化作用失衡引發的氧化應激是IPF發病的主要機制之一。

成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor-21，FGF-21)屬于FGF家族成員之一。它通過抑制活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生而抑制氧化應激反應[1-3]。研究報道發現FGF-21通過激活核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)保護小鼠肝臟免受D-半乳糖誘導的氧化應激和細胞凋亡[4]。此外，FGF-21通過激活Nrf2抑制巨噬細胞介導的炎癥反應，表明FGF-21具有抗炎作用[5]。FGF-21通過下調纖維化因子IV型膠原蛋白、纖溶酶原激活物抑制物1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)進而抑制腎纖維化[6]。但是FGF-21在博萊霉素(bleomycin,BLM)所致的肺纖維化中的作用機制尚未見報道。

本課題擬采用氣管內滴注BLM的方法建立小鼠肺間質纖維化模型，探討FGF-21和Nrf2對BLM誘導的炎癥反應及氧化應激所致的小鼠肺間質纖維化的作用，并進一步探討其對肺間質纖維化相關分子作用機制的影響，以期尋求新的治療策略。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

博萊霉素購自日本化藥株式會社；BCA購自Beyotime；PVDF膜購自Merk millipore；抗I型膠原蛋白(collagen I)、纖連蛋白(fibronectin)、Nrf2和GAPDH抗體購自Sigma；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GPx)及羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)檢測試劑盒均購自中國南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和TGF-β1的ELISA試劑盒購自博士德生物工程有限公司；Nrf2-siRNA(Si-Nrf2)和陰性對照siRNA(negative control siRNA, si-NC)慢病毒載體購自南京凱基生物公司。

2 方法

2.1動物模型構建及分組處理 40只昆明小鼠由第四軍醫大學提供，許可證號為SKXY(陜)2014-001，隨機分為5組，即對照(control)組、BLM組及不同劑量的FGF-21(1、2及5 mg/kg)處理組。將BLM溶于無菌生理鹽水中，對各組小鼠進行水合氯醛麻醉后，對除正常對照組外其余組以3 mg/kg的劑量對其進行氣管內滴注，制作小鼠肺損傷模型，正常對照組小鼠則滴注等量生理鹽水。然后根據分組情況腹腔注射不同劑量的FGF-21(1、2及5 mg/kg)，每天1次，連續21 d；另取小鼠分別經尾靜脈注射1×108PFU的si-Nrf2慢病毒載體和si-NC空載體，隔天注射一次。最后一天處死小鼠，留存小鼠肺組織及血清樣本。本研究中的所有動物實驗操作流程均應嚴格遵循《實驗動物保護條例》。

2.2Western blot檢測蛋白水平 取0.1 g肺組織，勻漿后抽提總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。取20 μg蛋白行10% SDS-PAGE，然后轉PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗collagen I、fibronectin和Nrf2抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入 II 抗(HRP標記)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL發光自顯影。以目的蛋白條帶密度與GAPDH條帶吸光度比值表示目的蛋白的相對水平。

2.3肺組織ROS含量的檢測 取不同處理組小鼠肺組織勻漿4 μL，加入396 μL PBS稀釋100倍。取100 μL稀釋液于酶標板中排列，并加入100 μL熒光染料DCFA染色，避光反應5 min，用熒光酶標儀檢測。

2.4抗氧化指標MDA、SOD和GPx的檢測 按照試劑盒說明書檢測不同處理組肺組織中MDA含量及SOD和GPx活性。

2.5ELISA檢測炎癥因子的表達水平 采用ELISA試劑盒分別檢測不同處理組肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1的表達水平，嚴格按照說明書進行操作。

2.6HYP含量的檢測 不同處理組小鼠肺組織勻漿后取上清，然后根據HYP測試盒說明書操作。

3 統計學處理

應用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0軟件分別進行數據分析及作圖，數據均以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 FGF-21抑制BLM誘導的炎癥應答

與control組相比，BLM組TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著升高(P<0.05)，而相對于BLM組，FGF-21明顯降低這些炎癥因子的分泌水平，且呈劑量依懶性(P<0.05)，表明FGF-21能夠減輕IPF過程中的炎癥反應，見圖1。

Figure 1. The effect of FGF-21 on BLM-induced inflammatory response. The levels of inflammatory mediators TNF-α (A), IL-1β (B) and IL-6 in the lung tissues were measured by ELISA. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group.

2 FGF-21抑制BLM誘導的氧化損傷

相比control組，BLM組胞內ROS的含量顯著增加(P<0.05)，而經FGF-21處理后，ROS的產生明顯降低(P<0.05)，見圖2A。BLM組肺組織中MDA含量顯著升高，經過FGF-21處理后，肺組織中MDA的含量明顯降低(P<0.05),見圖2B。BLM組SOD和GPx的活性較control組顯著降低(P<0.05)，而FGF-21處理后明顯增加SOD和GPx的活性(P<0.05)，見圖2C、2D。這些結果提示FGF-21防治肺纖維化的作用可能與提高機體的抗氧化能力有關。

Figure 2.The effect of FGF-21 on BLM-induced oxidative stress. A: the production of ROS was measured by DCFH-DA staining; B, C and D: the content of MDA and the activity of SOD and GPx were detected by commercially available kits. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs BLM group.

3 FGF-21降低BLM誘導的胞外基質分泌

BLM組肺組織中的collagen I和fibronectin蛋白水平較control組顯著上調(P<0.05)，FGF-21處理組肺組織中這2種蛋白的表達較BLM組明顯下調(P<0.05),見圖3A。 BLM組肺組織中TGF-β1的表達水平相比control組增高(P<0.05)，FGF-21處理后其表達明顯降低(P<0.05)，見圖3B。此外， BLM組中HYP的含量顯著高于control組，而FGF-21處理明顯減少HYP含量(P<0.05),見圖3C。

4 Nrf2信號參與調控FGF-21的抗肺纖維化作用

與BLM組相比，FGF-21明顯上調Nrf2的表達水平(P<0.05)，表明FGF-21能夠激活Nrf2信號通路，見圖4A。沉默Nrf2的表達明顯恢復炎癥因子IL-1β和IL-6的水平(P<0.05)，見圖4B，并增加了ROS的產生(P<0.05)，見圖4C，說明沉默Nrf2的表達能夠逆轉FGF-21介導的抗炎作用及抗氧化應激作用，提示FGF-21可能通過上調Nrf2表達、增加Nrf2活性而減輕BLM所致的肺纖維化。

Figure 3.The effects of FGF-21 on BLM-induced extracellular matrix production. A: Western blot analysis was used to determine the protein expression of collagen I and fibronectin; B: the expression level of TGF-β1 was measured by ELISA; C: the content of HYP was measured by commercially available kit. Mean±SD. n=8. * P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group.

Figure 4.FGF-21 suppressed BLM-induced pulmonary fibrosis by activating Nrf2. A: the protein expression of Nrf2 was determined by Western blot; B: the levels of inflammatory mediators IL-1β and IL-6 in the lung tissues were measured by ELISA; C: the production of ROS was measured by DCFH-DA staining. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs BLM group; &P<0.05 vs FGF-21+BLM+si-NC group.

討 論

博萊霉素誘導的肺纖維化模型早期主要表現為肺泡炎癥，繼而出現成纖維細胞異常增生及細胞外基質形成增多和沉積，最終出現肺纖維化。本研究采用氣管內滴注BLM的方法建立小鼠特發性肺間質纖維化模型。

肺纖維化發病過程中，肺組織中的中性粒細胞分泌大量的細胞因子和趨化因子,如TNF-α、IL-1β和IL-6，破壞機體內炎癥系統/抗炎系統之間的平衡，從而破壞正常的肺組織結構[7-8]。在BLM誘導的肺纖維化模型肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高；經FGF-21處理后，肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯降低，該結果表明FGF-21防治肺纖維化的作用可能與其抗炎能力有關。

氧化應激損傷被認為是導致和促進肺纖維化病理進程的一個重要因素，是IPF的重要發病機制[9]。ROS在肺纖維化發生、發展的病理生理過程中扮演重要角色。越來越多證據表明BLM誘導肺纖維化是由于BLM能夠促進ROS產生，增加氧化物負擔，使得肺內氧化物、抗氧化物失衡。MDA是自由基作用于脂質后發生或氧化反應的終產物，是氧化應激的標志物；SOD是一種重要的內源性抗氧化酶，具有清除氧自由基的作用。GPx是清除H2O2與有機過氧化物的重要抗氧化酶。有研究發現氧化損傷可降低FGF-21的表達量，表明FGF-21與氧化應激存在一定的關系[10]。本研究結果發現在BLM誘導小鼠肺纖維化模型中，ROS生成及MDA含量顯著升高，且SOD和GPx等抗氧化酶活性均顯著降低，提示肺組織發生增強的氧化應激，使脂質過氧化產物增多；FGF-21處理后能夠明顯逆轉這種現象。綜合上述結果表明FGF-21緩解BLM造成的肺纖維化，可能與抑制自由基過氧化物的生成、增加抗氧化酶活性進而減輕氧化應激反應發揮其抗纖維化的作用。

TGF-β1能介導成纖維細胞的趨化、增殖及分化，促進細胞外基質合成、聚集及減少細胞外基質降解等效應，被認為是肺纖維化過程最關鍵細胞因子。HYP是膠原的降解產物，可作為BLM誘導肺纖維化病變的重要指標。該結果表明FGF-21減少BLM誘發的肺纖維化的間質膠原沉積，下調TGF-β1的表達水平，并降低肺內的HYP的含量而起到抗纖維化的作用。

有研究發現Nrf2在IPF中低表達，且Nrf2激活能夠增加抗氧化防御及肌纖維母細胞的去纖維化[11]。此外，FGF-21通過減少腎脂積累和抑制炎癥、氧化應激和纖維化，從而緩解了FFA及糖尿病引起的腎損害[12]。另有研究表明Nrf2能夠正調控FGF-21的表達[13]。與前期研究結果一致，在纖維化小鼠模型中，FGF-21能夠激活Nrf2信號，更為重要的Nrf2沉默能夠阻斷FGF-21的抗炎及抗氧化應激作用，表明Nrf2參與FGF-21介導的抗纖維化保護效應。