配合飼料和血液對菲牛蛭水蛭素活性及非特異性免疫指標的影響

■熊 偉 秦國兵 姚俊杰王 雪 唐 鑫

(貴州大學動物科學學院水產科學系貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽550025)

菲牛蛭（Poecilobdella manillensis）是吸血類水蛭的一種，俗名金邊螞蟥、馬尼拉醫蛭，隸屬環節動物門（Annelida）醫蛭科（Hirudinidae）牛蛭屬（Poecilobdella Whitman）。菲牛蛭具有水蛭素(hirudin)、纖維蛋白溶解酶、抗血小板聚集成分和抑菌成分等多種活性成分，水蛭素是最主要的活性組分[1]?，F代醫學表明，水蛭素在心腦血管疾病、動脈粥樣硬化、敗血休克、高血壓以及缺少抗凝血酶Ⅲ因子等疾病方面具有巨大的優越性和廣闊的應用前景[2-3]。由于過度的捕撈及生態環境惡化等諸多原因的影響，菲牛蛭資源急劇下降。因此，人們在探究菲牛蛭人工養殖方法，其中用配合飼料養殖也是人們關注的熱點。

近年來，人們從菲牛蛭攝食與生長[4]、養殖方式[5]、病害防治[6]、繁殖[7]等方面做了很多工作，菲牛蛭的人工繁殖也取得成功。但是菲牛蛭還是采用粗放式的血液投喂，而血液的不易獲得、易腐敗、易污染、質量不穩定等缺點，給養殖戶帶來諸多不便，限制了菲牛蛭的規?；B殖。因此，研究菲牛蛭的人工配合飼料是急待解決的問題。菲牛蛭以動物性血液為食，2014年李軍等[8]報道了菲牛蛭可以攝食配合飼料。相關研究表明餌料的改變會引起抗免疫相關酶的改變[9]，同時能刺激免疫應答，保護機體免受損傷[10]。而配合飼料養殖條件下，菲牛蛭免疫能力和水蛭素活性是否受到影響是值得我們探索的問題。所以，本研究采用雞血和自制配合飼料對菲牛蛭進行飼養，從水蛭素活性和非特異性免疫指標兩個方面對配合飼料做出評價，以期為規?；B殖菲牛蛭提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菲牛蛭購買于貴州蛭臻寶生物科技有限公司。隨機挑選大小均勻、體格健壯且體表無病，平均體重為（2.83±0.71）g，平均體長（5.33±0.54）cm的菲牛蛭幼苗。配合飼料主要成分和含量為：血球蛋白（NP-90，4%）、血漿蛋白（NP-2002，5%）、氯化鈉（2 g）、L-精氨酸（0.175 g）、維生素C(0.2 g)，加入純凈水到1 000 ml；血液采用菜市場收集的雞血（不加鹽、不加水），打漿機打成血漿；灌腸投喂。試驗用水采用花溪河河水，pH值7.5～7.8，水溫20～26 ℃，溶解氧6～9 mg/l。試驗在塑料大棚中進行，養殖箱規格為35 cm×25 cm×20 cm，為防逃采用篩娟網密封，并在篩娟網上裝置拉鏈方便飼養及換水。

1.2 試驗設計

試驗設置2個組，配合飼料組和血液組，每個組3個重復。養殖密度為40尾/箱。試驗組采用自制配合飼料灌入風干豬血腸衣中投喂，對照組采用雞血打成血漿灌入風干豬血腸衣中投喂，養殖周期60 d，投喂頻率為每3 d 1次，每天換水量50%，停飼1周采樣。

1.3 樣品采集

每個重復隨機抽取28尾菲水蛭，取3尾直接放入-80℃冰箱凍存，用于水蛭素活性測定。剩余25尾置于冰上解剖取腸道及嗉囊組織，取樣菲牛蛭結構圖參照高勝濤[11]（取樣編號：配合飼料組，嗉囊記為“ss”，腸道記為“sc”；血液組，嗉囊記為“xs”，腸道記為“xc”）。樣品置于-80℃冰箱保存備用。

1.4 指標測定

組織蛋白、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）試劑盒均購買于南京建成生物工程研究院。水蛭素活性測定采用《中國藥典》2010版規定的測定方法及陳華友等[12]提供的方法（數據體現時，在相應標號前增加指標英文縮寫，如“LSZss”代表配合飼料組嗉囊組織中溶菌酶的活力）。

1.5 數據分析

數據結果采用SPSS 19.0進行統計分析，所得結果以“平均值±標準差”表示。運用LSD和Duncan's法檢驗進行多重比較。P＜0.05認為有顯著差異。

2 結果

2.1 配合飼料和血液飼養對飼養菲牛蛭水蛭素活性的影響（見表1）

表1 配合飼料和血液飼養對菲牛蛭水蛭素活性的影響（U/g）

由表1可知，血液組水蛭素活性為(76.171 9±0.390 6)U/g，配合飼料組水蛭素活性為(75.390 6±0.391 8)U/g。血液組水蛭素活性略高于配合飼料組，但在統計學意義上，差異性不顯著（P＞0.05）。

2.2 配合飼料和血液飼養對菲牛蛭免疫指標的影響

配合飼料和血液飼養對菲牛蛭溶菌酶（LSZ）的影響見圖1。配合飼料組腸道LSZ活力顯著低于血液組（P＜0.05），LSZ活力分別為（13.119±1.321）U/mg prot.和（62.104±6.146）U/mg prot.；配合飼料組嗉囔LSZ活力稍低于血液組，差異性不顯著（P＞0.05），LSZ活力分別為（30.223±5.642）U/mg prot.和（39.962±6.014）U/mg prot.。

配合飼料和血液飼養對菲牛蛭堿性磷酸酶（AKP）的影響見圖2。配合飼料組腸道AKP活力顯著高于血液組（P＜0.05），AKP活力分別為（148.317±8.144）U/mg prot.和（18.664±1.627）U/mg prot.；配合飼料組嗉囔AKP活性稍高于血液組，差異性不顯著（P＞0.05），AKP活力分別為(14.333±1.154)U/mg prot.和(6.333±0.577)U/mg prot.。

配合飼料和血液飼養對菲牛蛭酸性磷酸酶（ACP）的影響見圖3。配合飼料組腸道ACP活力（298.478±4.212）U/mg prot.顯著高于血液組ACP活力（67.591±5.384）U/mg prot.（P＜0.05）；配合飼料組嗉囔ACP活力（25.926±0.512）U/mg prot.稍高于血液組ACP活力（17.012±1.235）U/mg prot.，差異性不顯著（P＞0.05）。

圖1 配合飼料和血液飼養對菲牛蛭的溶菌酶活力影響

圖2 配合飼料和血液飼養對菲牛蛭的堿性磷酸酶活力影響

圖3 配合飼料和血液飼養對菲牛蛭的酸性磷酸酶活力影響

3 討論

3.1 配合飼料和血液飼養對菲牛蛭水蛭素活性的影響分析

水蛭素是水蛭唾液腺分泌物中的一種蛋白質，是迄今發現的最強的天然凝血酶特效抑制劑，是活血化淤的通經良藥[13]。菲牛蛭具有多種活性成分，如菲牛蛭素、纖維蛋白溶解酶、抗血小板聚集成分和抑菌成分等，而最主要的活性成分為水蛭素（菲牛蛭素）[1]。在菲牛蛭養殖中，水蛭素活性作為菲牛蛭養殖產品質量的評判標準。在貴州養殖條件下，本實驗室朱忠勝[14]得出幼體菲牛蛭水蛭素活性為(73.24±3.65)U/g。本試驗中，水蛭素活性血液組為(76.171 9±0.390 6)U/g，配合飼料組為(75.390 6±0.391 8)U/g，在統計學意義上，血液組和配合飼料組水蛭素活性無顯著差異（P＞0.05）。表明在養殖周期為60 d，配合飼料對菲牛蛭水蛭素活性無影響。說明人工配合飼料可以替代自然的血液飼料。

3.2 配合飼料和血液飼養對菲牛蛭LSZ的影響分析

溶菌酶(LSZ)可以分解連接N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）殘基之間的β-1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，導致細菌細胞壁破裂、內含物逸出而使細菌溶解死亡，是許多生物先天性免疫系統的重要組成成分。LSZ廣泛存在植物、無脊椎動物和高等動物，依賴于物種表現出了嚴格且特異的時空表達模式[15]。在魚類中，溶菌酶廣泛存在于脾臟、腎臟、頭腎、皮膚、心臟、腸和血液中[16]。而關于菲牛蛭溶菌酶存在鮮有報道，本試驗在菲牛蛭腸道及嗉囊組織中均檢測到溶菌酶活力。

菲牛蛭屬于吸血類水蛭，一次吸血量能達到身體體積的3倍左右，半年不攝食不影響其生理功能，吸食的血液保存在嗉囊中。而血液易變質，容易滋生腐敗細菌，但在菲牛蛭體內能保存完好，主要是溶菌酶的作用。溶菌酶是國內外研究較早、較多的一種酶類生物保鮮劑，能抑制其體內酶活性，阻止易引起水產品腐敗變質的微生物生長繁殖，延緩腐敗進程[17]。相關研究表明塞內加爾鰨感染發光菌后脾臟、頭腎和肝臟中溶菌酶含量增加[18]；牙鲆經愛德華氏菌感染后溶菌酶表達量在心臟、腸和血液中顯著提高[19]。菲牛蛭攝食配合飼料后，腸道組織中配合飼料組顯著低于血液組，嗉囊組織中LSZ活力配合飼料組稍低于血液組，降低了菲牛蛭的LSZ活力。形成這一結果的可能原因是菲牛蛭本身具有的溶菌酶對攝入食物有一定的保存作用，當血液變質滋生腐敗細菌時，促進溶菌酶含量上調，更能有效地殺滅有害細菌，保證食物血液的消化吸收；而配合飼料在加工上經過高溫滅菌，不易滋生腐敗細菌，不促進溶菌酶含量的上調，使溶菌酶含量處于一個較低水平。

3.3 配合飼料和血液飼養對菲牛蛭ACP和AKP的影響分析

堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）是兩種非特異免疫酶，參與磷酸酶基團代謝與轉移。AKP催化磷酸基團的轉移反應，催化磷酸單酯的水解反應；ACP是溶酶體的標志酶，主要定位于溶酶體和內膜系統。對外源異物的磷酸酯外表面進行水解作用，在免疫反應中發揮重要的作用[20-21]。同時，AKP和ACP與水產動物機體的生長密切相關，在魚體營養的吸收、利用中發揮著重要的作用[22]。飼料中添加甘露聚糖酶[23]、殼聚糖[24]等對水產動物AKP和ACP活力有促進作用，而環境的脅迫（pH值、鹽度、運輸等）會導致AKP和ACP活力下降。在菲牛蛭腸道組織中配合飼料組AKP和ACP活力顯著高于血液組，嗉囊組織中配合飼料組AKP和ACP活力稍高于血液組。從AKP和ACP活力上看，配合飼料飼養菲牛蛭能達到或超過血液飼養水平。

菲牛蛭屬于吸血類水蛭，嗉囊的功能主要是貯藏食物，消化吸收的能力較弱；而菲牛蛭腸道是主要的消化吸收的場所。磷酸酶普遍存在于動物的各組織中，如腸組織堿性磷酸酶、胎盤堿性磷酸酶和生殖細胞堿性磷酸酶等。腸組織AKP在保持腸道平衡中發揮重要作用，飼料可以影響它的活力，具有參與調節碳酸氫鹽分泌和十二指腸pH值、通過脫磷酸作用控制細菌內毒素誘發的腸道炎癥等功能[25]。凡是物質交換、吸收運轉旺盛的器官中，都顯示出AKP的高活力[26]。ACP參與磷酸酯的代謝，還參與能量轉換以及信號傳導等重要生命活動。本研究中血液和配合飼料情況下，腸道組織中AKP和ACP活力均顯著高于嗉囊組織（P＜0.05），可能原因為菲牛蛭腸道的物質交換、吸收運轉旺盛程度高于嗉囊，導致菲牛蛭腸道組織中AKP和ACP活力均顯著高于嗉囊組織中AKP和ACP活力。