谷氨酰胺和精氨酸對烏鱧生長與免疫功能的影響

■孔祎頔 鄭 偉，2 陳秀梅 劉洪健，3 單曉楓 陳玉珂 王桂芹*

（1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春130118；2.延邊州水產技術推廣站，吉林延邊133002；3.吉林省水產技術推廣站，吉林長春130022）

谷氨酰胺 （Glutamine，Gln）是魚類體內含量最多的必需氨基酸，在代謝過程中至關重要，具有促進魚類生長發育、提高其抗病能力、改善腸道組成結構及調節免疫功能等作用（王桂芹等，2012）。同時，精氨酸 （Arginine，Arg）也作為魚類體內重要的功能性必需氨基酸，在參與機體蛋白質、一氧化氮、多胺及肌酸的合成，促進動物生長和免疫功能的提高等方面意義深遠（王連生等，2017）。Gln受熱易分解生成有毒的焦谷氨酸和氨（徐奇友等，2009），但Gln二肽因其穩定性好、水溶性高，已在畜禽生產（姜俊等，2004）和水產養殖（楊奇慧等，2008）等方面有應用。在羅非魚（Oreochromis mossambicus）（楊奇慧等，2008）、石斑魚（Epinephelussp）（Lin等，2005）、中華鱉（Trionyxsinensis）（溫安祥等，2008）、鮭（Salmoniformes）（陳巨星等，2004）等飼料中添加Gln，可提高生產性能、腸上皮細胞的增殖和分化、免疫功能和抗病和緩解免疫應激的作用。團頭魴（Megalobrama amblycephala）幼魚適宜生長、氨基酸吸收以及魚體的免疫力和抗病原菌感染能力強的適宜精氨酸需求量為1.81%～2.35%（廖英杰等，2014）。提高斑點叉尾鮰（Ietaluruspunctatus R）對愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）的抵抗力的適宜精氨酸需求量1.75%～2.45%（Tesser等，2005）、增強吞噬細胞的活性和血液中紅細胞的數目（PoMenz等，2014）。關于Ala-Gln和Arg共同添加對烏鱧生長和免疫的影響至今沒有相關報道。本試驗選取肉質細嫩、口味鮮美、營養豐富、生長快、抗逆性強的名優土著品種烏鱧作為研究對象，探討在飼料中添加Ala-Gln和Arg最適添加量對烏鱧生長和免疫功能的影響，為開發水產養殖業中Ala-Gln和Arg的共同使用的免疫添加劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及飼料

以魚粉為蛋白源，配制添加Ala-Gln（含量99%，北京萊瑞森醫藥科技有限公司）和Arg（含量99%，浙江省益萬生物技術有限公司）的等氮等能（42.5%粗蛋白質、18.5 MJ/kg）的七組飼料。Ala-Gln和Arg的添加梯度的設置原則是以Ala-Gln和Arg各自對烏鱧生長的最適添加量（5.0 g/kg和20 g/kg）為100%，等比例添加0%、20%、40%、60%、80%、100%、120%（見表1）。飼料原料經粉碎、稱重、混均、擠壓成直徑為1.5 mm的顆粒，曬干后，-20℃保存、備用。采用國標法測定飼料中的水分、粗蛋白質、粗灰分和粗脂肪，飼料配方見表2和表3。

表1 試驗設計

1.2 試驗設計及飼養管理

試驗烏鱧購于遼寧劉二堡漁場，試驗前暫養于室內玻璃水族箱中。暫養期間投喂基礎日糧（蛋白質含量42%）馴化15 d。選取體質健康、大小一致的烏鱧，體質量為（9.56±0.24）g，試驗開始前，停食1 d。隨機分配到21個玻璃水族箱中，七個處理，每處理3個重復，每重復30尾魚。每天09：00、16：00飽食投喂兩次。飼養8周，pH值為7.1±0.1，氨氮＜0.5 mg/l，水溫為23～30 ℃，溶解氧＞5.0 mg/l。

1.3 樣品收集及指標計算

表2 試驗飼料（%干物質基礎）

表3 試驗飼料營養組成（干物質基礎）

飼養8周后取樣，計算平均增重率、飼料效率、攝食率、蛋白效率及肥滿度，取側線上背鰭下的白肌，用于營養成分的測定。

平均增重率（%）=100×（Wt-W0）/W0

飼料效率（%）=100×（Wt-W0）/I

攝食率（%/d）=100×I/（W0+Wt）/2t

蛋白效率=（Wt-W0）/（I×C）

肥滿度（g/cm3）=（W/L3）×100

式中：I——攝入飼料的重量（g）；

t——試驗時間（d）；

W0、Wt——試驗初始和結束時烏鱧的總重量（g）；

C——飼料蛋白質的含量（%）；

W、L——每尾魚的體重（g）和體長（cm）。

1.4 抗氧化酶、免疫酶和細胞因子的測定

飼養8周，停食24 h，每缸隨機取10尾魚，用MS-222（200 mg/l）麻醉，尾靜脈采血，4 ℃靜置12 h，離心取血清，之后取頭腎、脾臟和肝臟，-20℃保存待測。分別采用黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法、比濁法、硝酸還原酶法、考馬斯亮蘭法、雙抗體夾心ELISA法、放射免疫分析法測定過氧化物歧化酶（SOD）活性、血清谷胱甘肽過氧化物酶活力（GSHPx）、溶菌酶（LZM）活性、一氧化氮（NO）含量、蛋白含量、血清中IL-1β水平、血清IL-2的含量。

1.5 攻毒試驗

試驗結束時，每組取60尾，三個平行，采用嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），活化后用無菌生理鹽水稀釋，按100 g魚體重0.1 ml腹腔注射菌液（菌液濃度為6×109cells/ml，是7 d內魚死亡一半時的菌液濃度和注射劑量），觀察1周，統計烏鱧死亡率并計算其攻毒后存活率。

1.6 統計分析

采用SPSS（20.0）軟件進行單因素方差分析，用Duncan's多重比較進行組間差異顯著性比較。數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 Ala-Gln和Arg對烏鱧生長的影響（見表4）

由表4可知，飼料中Ala-Gln和Arg添加比例增加到60%時，烏鱧平均增重率顯著高于20%組、40%組和對照組（P＜0.05），但Ala-Gln和Arg添加比例在80%～120%時，烏鱧平均增重率不再提高，且各組之間差異不顯著。將飼料中Ala-Gln和Arg添加量的比例（X）和試驗烏鱧平均增重率（Y）做拋物線回歸分析，所得方程為：Y=-76.907X2+110.50X+151.03，R2=0.892 4（Xmax=71.84%）。根據拋物線回歸分析結果與方差分析結合起來得出，烏鱧平均增重率在Ala-Gln和Arg添加比例為60%～71.84%時達到最大值，即Ala-Gln最適添加范圍為3.0～3.59 g/kg、Arg最適添加范圍為12.0～14.37 mg/kg。

表4 Ala-Gln和Arg對烏鱧生長及飼料利用的影響

由表4同時可知，飼料中Ala-Gln和Arg添加比例為20%～60%時，烏鱧飼料效率和蛋白效率隨其添加比例的增加而升高，且Ala-Gln和Arg添加比例為60%時，烏鱧蛋白質效率和飼料效率均顯著高于對照組（P＜0.05），但是當Ala-Gln和Arg添加比例在80%～120%時，飼料效率和蛋白質效率均不再升高且各組之間差異不顯著（P＞0.05）。將Ala-Gln和Arg添加比例（X）和烏鱧蛋白效率（Y）做回歸分析為：Y=-0.339 8X2+0.467 3X+2.137 4，R2=0.901 2（Xmax=68.76%）拋物線回歸分析結果與方差分析結合起來得出，烏鱧最大蛋白效率的最適Ala-Gln和Arg添加比例為60%～68.76%，即Ala-Gln最適添加范圍3.0～3.40 g/kg、Arg最適添加范圍12.0～13.75 mg/kg。

2.2 Ala-Gln和Arg對烏鱧肌肉營養成分的影響（見表5）

表5 Ala-Gln和Arg對烏鱧肌肉營養成分的影響（%）

由表5可知，飼料中Ala-Gln和Arg的添加比例在20%～80%時，烏鱧肌肉中粗蛋白質含量隨著其添加比例的增加呈上升趨勢，而飼料中Ala-Gln和Arg添加比例為80%時，粗蛋白質含量顯著高于對照組（P＜0.05），但當Ala-Gln和Arg添加比例為100%和120%時，粗蛋白質含量與對照組及其他試驗組差異都不顯著（P＜0.05），且二者之間差異不顯著。烏鱧肌肉中的粗灰分、粗脂肪和水分各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 Ala-Gln和Arg對烏鱧抗氧化酶、免疫酶和細胞因子的影響（見表6）

表6 Ala-Gln和Arg對血清和肝臟烏鱧SOD和GSH-Px的影響

由表6可知，血清和肝臟GSH-Px隨Ala-Gln和Arg的添加而增加。當60%添加量時，血清和肝臟GSH-Px顯著高于對照組，添加120%組血清GSH-Px顯著高于20%、40%、60%組和對照組（P＜0.05），添加100%組肝臟GSH-Px顯著高于對照組和20%～60%添加組（P＜0.05），與80%和120%添加組差異不顯著。血清和肝臟SOD隨Ala-Gln和Arg的添加而增加，120%添加組的血清SOD顯著高于對照組和20%、40%組（P＜0.05），80%添加組的肝臟SOD顯著高于對照組、20%和40%添加組，與60%、100%和120%添加組差異不顯著。

Ala-Gln和Arg對烏鱧頭腎和脾臟的LZM活性和NO含量的影響見表7。頭腎和脾臟的LZM活性都有隨Ala-Gln和Arg的添加出現先升高后降低或平穩的趨勢，20%添加組的頭腎LZM活性顯著高于對照組（P＜0.05），40%添加組的頭腎LZM活性顯著高于對照組和20%添加組（P＜0.05），與60%添加組差異不顯著。80%～120%添加組的頭腎的LZM活性差異不顯著。20%～60%添加組脾臟的LZM活性顯著高于對照組（P＜0.05），80%～120%添加組差異不顯著；頭腎和脾臟的NO含量都隨Ala-Gln和Arg的添加量的增加先升后降，60%添加組的頭腎和脾臟NO含量都顯著高于其他各組和對照組（P＜0.05）。

表7 Ala-Gln和Arg對烏鱧頭腎和脾臟LZM活性和NO含量的影響

Ala-Gln和Arg對烏鱧血清PBL的IL-1β和IL-2以及攻毒存活率的影響見表8。IL-1β隨Ala-Gln和Arg的增加而降低，60%添加組的IL-1β顯著低于對照組、20%和40%添加組（P＜0.05），但與80%～120%添加組差異不顯著。IL-2隨Ala-Gln和Arg的增加先增加后降低，且在80%添加組達到最大值，各試驗組均顯著高于對照組（P＜0.05）。攻毒存活率隨Ala-Gln和Arg的增加而升高，60%添加組的攻毒存活率顯著高于對照組、20%～40%添加組（P＜0.05），與80%～120%添加組差異不顯著（表8）。

表8 Ala-Gln和Arg對烏鱧血清PBL的IL-1β和IL-2以及攻毒存活率的影響

3 討論

3.1 Ala-Gln和Arg對烏鱧生長、飼料利用和營養成分的影響

在飼料中適量添加Ala-Gln，可有效促進動物生長、飼料利用和蛋白質的合成。在德國鏡鯉（Cyprinus carpio L.）日糧中添加0.75%Ala-Gln能顯著提高其生長、飼料利用和蛋白質的沉積（朱青等，2009）。

Gln可以提高大鼠游離甲狀腺素T3和T4含量，通過上調小腸黏膜細胞IGF-ImRNA的表達量以增加IGF-I自分泌和旁分泌，以致促進蛋白質合成，從而提高生長性能（謝建新等，2001）。對軍曹魚（Rachycentron canadum）幼魚（14.7 g）（趙紅霞等，2007）、團頭魴（2.6 g）（廖英杰等，2014）、雜交條紋鱸（Moront Saxatuis）（Chang等，2012）、印度鯰（Kryptoglanis）（Khan等，2012）等的生長起促進作用、蛋白質沉積和免疫力提高的精氨酸含量分別是2.38%（占飼料蛋白的5.17%）、1.81%、1.0%、1.75%。石斑魚日糧Arg含量在2.01%～3.08%時，肌肉中粗蛋白質含量隨著Arg增加而升高（Zhou等，2012）；在斑點叉尾鮰飼料中添加1.5%～2.5%Arg，可見Arg含量與魚體粗脂肪含量呈負相關，同時與水分含量也呈負相關（Khan等，2012）。在本試驗中，Ala-Gln和Arg添加比例為60%添加組和80%添加組比100%添加組（即分別添加Ala-Gln和Arg對烏鱧的最適添加量）效果顯著，隨著Ala-Gln和Arg添加比例的增加，烏鱧攝食率、蛋白質效率和飼料效率顯著提高，說明飼料中添加Arg和Ala-Gln能有效提高飼料蛋白質的利用率，從而促進烏鱧生長。

3.2 Ala-Gln和Arg對烏鱧免疫和抗病的影響

Gln能夠有效提高機體抗應激能力，主要表現在營養代謝、提供能量、抑制病菌和抗氧化等方面。Gln二肽可提高日本對蝦（Penaeus japonicus）（葉均安等，2009）、哲羅魚（Hucho taimen）（徐奇友等，2009）的抗氧化能力，緩解應激造成的過氧化損傷，從而利于生長。同時，Gln的免疫調節作用一方面作用于炎癥早期，抑制促炎因子TNF、IL-1、IL-6的過多產生，從而避免過強的炎癥反應；另一方面可作用于補償期，促進淋巴細胞增殖及IL-2的產生，避免促炎細胞因子的產生而造成的免疫抑制。此外，T淋巴細胞分泌lL-2及其受體的表達也依賴于外源性Gln的補充（Crawford等，1985）。持續應激時，巨噬細胞內Arg被大量用于NO的生成而導致缺乏，因一氧化氮合酶（NOS）直接催化精氨酸產生NO，Gln可促進NOS基因的表達，Gln可促進巨噬細胞和中性粒細胞分泌NO，間接調節Arg的需求量以致使NO的生成，因此，飼料中必須補充足夠的Arg和Ala-Gln。Ala-Gln可顯著提高日本對蝦血清中的LZM活性（葉均安等，2009）。在團頭魴（2.6 g）飼料中添加2.35%Arg，其幼魚的免疫力和抗病原菌感染能力均達到最高（廖英杰等，2014）；添加1.0%Arg能顯著提高雜交條紋鱸血清LZM活性，顯著提高細胞外超氧陰離子和中性粒細胞氧自由基的產生（Chang等，2012）；斑點叉尾鮰接種愛德華氏菌7 d后，添加4%Arg組血清愛德華氏菌抗體效價顯著提高，14 d后顯著提高對愛德華氏菌的抵抗能力（Pohlenz等，2012）；在日糧中添加2%Arg能顯著提高斑點叉尾鲴感染愛德華氏菌后的成活率（Buentello等，2007）。本試驗飼料中添加Ala-Gln和Arg可通過影響血清和肝臟的SOD和GSH-Px含量，提高其抗氧化功能，通過影響頭腎和脾臟的LZM活性和NO含量以提高其免疫力，通過調節IL-1β和IL-2來提高其抗炎活性，通過影響攻毒存活率來提高抗病能力，具有顯著的免疫和抗病保護作用。

4 結論

綜上所述，在飼料中添加Ala-Gln和Arg在一定程度上可以有效促進烏鱧生長、飼料利用和提高抗氧化、免疫保護的能力，建議具體Ala-Gln和Arg的適宜添加范圍為3.0～3.4 g/kg和12.0～13.75 mg/kg。