魚用功能性卵黃粉對鰻鱺的免疫保護和生長性能的影響

■ 李英英 宋鐵英 江興龍 葛均青 陳 曦2，*

（1.鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，福建廈門361021；2.福建省特種水產配合飼料重點實驗室，福建福州350300；3.福建省農科院生物技術研究所，福建福州350003）

我國的水產養殖業經過30多年的發展，目前產量已經位居全球首位[1-2]，但隨著水產養殖集約化和規?；陌l展，水產動物病害頻發。嗜水氣單胞菌是水產養殖動物暴發性傳染病的主要病原菌之一[3]，在生產上有極大的危害性。目前長期大量使用抗生素的防治措施容易使病原菌產生耐藥性[4-5]，因此，研究抗生素或化學藥物替代品已成為當前研究的熱點和難點[6]。

卵黃抗體（IgY）具有類似哺乳動物IgG的免疫活性，并且理化性質穩定[7]，特異性強，不產生耐藥性[8]，且對腸道正常的菌群無副作用[9]，近年來，卵黃抗體作為抗生素替代品或飼料添加劑已廣泛的運用于畜禽疾病的防治[10-12]。前期研究中，本研究團隊已經成功制備了多價嗜水氣單胞菌腸外膜蛋白（MOMP）-ISCOMs保護性抗原[13]，并制備了相應的魚用功能性卵黃粉[14]，本文擬通過對該魚用功能性卵黃粉所含抗嗜水氣單胞菌MOMP卵黃抗體的效價和特異性分析，結合對鰻鱺的免疫攻毒保護和投喂生長性能分析，為該魚用功能性卵黃粉防控嗜水氣單胞菌所引起的疾病提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 魚用功能性卵黃粉所含卵黃抗體效價及特異性分析

1.1.1 ELISA法檢測卵黃抗體免疫效價

以前期研究[15]中所獲得的3株代表菌（ZN1、TPS30和WC）的嗜水氣單胞菌外膜蛋白（MOMP）作為包被物（3株菌MOMP的蛋白比例為1∶1∶1），包被量為10 μg/ml，第1抗體為1∶20開始倍比稀釋的卵黃抗體，第2抗體為1∶20 000稀釋的HRP酶標記羊抗雞IgG（Sigma）。OPD顯色，終止后讀取OD492值，以S/N≥2.1結果為陽性。

1.1.2 卵黃抗體Western blot分析

將上述3株代表菌（ZN1、TPS30和WC）的嗜水氣單胞菌外膜蛋白（MOMP）進行SDS-PAGE電泳，半干法轉印至NC膜，用5%BSA封閉后依次加入第1抗體和第2抗體進行孵育。其中第1抗體為1∶100稀釋的卵黃抗體，第2抗體為1∶20 000稀釋的HRP酶標記羊抗雞IgG（Sigma）。DAB法顯色。

1.2 魚用功能性卵黃粉對鰻鱺的免疫攻毒保護試驗

試驗鰻鱺購自福建省長樂某鰻鱺場，規格為（80±5）g/尾，18尾隨機分為試驗組和對照組，每組9尾。鰻鱺在試驗室魚箱中養殖，溫度25℃左右，每日換水1/3。對照組投喂鰻鱺飼料，試驗組在鰻鱺飼料中添加0.3%魚用功能性卵黃粉，每天上午和下午各投喂一次，連喂13 d后，2組鰻鱺每只由腹腔注射1×108CFU的ZN1，每天觀察1次，連續觀察15 d，計算鰻鱺存活率。

1.3 魚用功能性卵黃粉對鰻鱺的生長性能測定

魚用功能性卵黃粉對鰻鱺的生長性能的應用分別在福建省長樂市、尤溪縣和福清市的3家商品化鰻鱺養殖場進行,統計試驗組和對照組鰻鱺總投料量、總增重量，每口池隨機抽取適當尾數鰻鱺測定規格，計算尾數和成活率，比較試驗組和對照組增重率、飼料轉化率和死亡率。

1.3.1 生長性能測定試驗1（長樂）

長樂的某鰻鱺養殖場的試驗。隨機選取30口同等條件池，15口池設為試驗組，15口池設為對照組，試驗組每池平均14 758尾，每尾平均123.1 g，對照組每池平均11 156尾，每尾平均137.9 g。魚用功能性卵黃粉按0.3%的量拌料口服，對照組投喂未添加魚用功能性卵黃粉的同質飼料，養殖周期109 d。

1.3.2 生長性能測定試驗2（尤溪）

在尤溪縣鰻鱺養殖場，隨機選取4口同等條件池，2口池設為試驗組，2口池設為對照組。試驗組2口池塘分別為21 996尾和21 600尾，均重分別為153.8 g/尾和138.9 g/尾，對照組2口池塘分別為24 528尾和16 720尾，均重分別為142.9 g/尾和131.6 g/尾。按照飼料重量0.3%的比例添加魚用功能性卵黃粉，混合均勻后投喂。對照組投喂未添加魚用功能性卵黃粉的同質飼料，養殖周期56 d。

1.3.3 生長性能測定試驗3（福清）

在福清市鰻鱺養殖場，隨機選取4口同等條件池，2口池設為試驗組，2口池設為對照組，養殖品種為日本鰻。試驗組2口池塘分別為21 461尾和27 899尾，均重分別為181.2 g/尾和178.6 g/尾，對照組2口池塘分別為18 948尾和26 396尾，均重分別為181.29 g/尾和172.4 g/尾。按照飼料重量0.3%的比例添加魚用功能性卵黃粉，混合均勻后投喂。對照組投喂未添加魚用功能性卵黃粉的同質飼料，養殖周期52 d。

2 結果

2.1 魚用功能性卵黃粉所含卵黃抗體特異性及效價分析

ELISA效價檢測顯示，魚用功能性卵黃粉所含MOMP卵黃抗體對嗜水氣單胞菌3株代表菌的外膜蛋白（MOMP）抗原的抗體效價均達到1∶10 240（表1）。將魚用功能性卵黃粉所含MOMP卵黃抗體與嗜水氣單胞菌3株代表菌的MOMP進行Western blot染色結果顯示，卵黃抗體能與嗜水氣單胞菌3株代表菌的MOMP抗原特異結合（圖1），說明制備的卵黃抗體具有對嗜水氣單胞菌外膜蛋白抗原的良好特異性。

表1 魚用功能性卵黃粉對嗜水氣單胞菌MOMP抗原的抗體效價

圖1 嗜水氣單胞菌MOMP卵黃抗體對3種嗜水氣單胞菌MOMP的Western-blot結果

2.2 魚用功能性卵黃粉對鰻鱺的免疫攻毒保護試驗（見表2）

表2 魚用功能性卵黃粉投喂鰻鱺后抵抗嗜水氣單胞菌攻擊的存活率比較

由表2結果顯示，飼喂魚用功能性卵黃粉13 d后，試驗組的鰻鱺攻毒后15 d成活率較對照組提高75.2%（表2），說明鰻鱺飼喂魚用功能性卵黃粉后對嗜水氣單胞菌具有攻毒保護作用。

2.3 鰻鱺飼喂魚用功能性卵黃粉后生長性能測定

2.3.1 鰻鱺生長性能測定1（長樂）

長樂鰻鱺養殖場的結果顯示，添加魚用功能性卵黃粉的試驗組鰻鱺的增重較對照組提高42.9%，飼料轉化效率比對照組提高10.7%（圖2A），兩者死亡率差別均較低，無明顯差別（圖2B）。

2.3.2 鰻鱺生長性能測定2（尤溪）

在尤溪縣鰻鱺養殖場投放按照飼料重量0.3%的比例添加魚用功能性卵黃粉的飼料的試驗結果表明，加功能性卵黃粉前后，試驗組平均增重比對照提高了13.6%，平均飼料轉化率提高了3.11%（圖3A），試驗組與對照組的死亡率均較低，差別不顯著（圖3B）。

圖2 長樂某鰻鱺養殖場投喂魚用功能性卵黃粉生長性能比較

圖3 尤溪某鰻鱺養殖場投喂魚用功能性卵黃粉養殖效果

2.3.3 鰻鱺生長性能測定3（福清）

在福清鰻鱺養殖場，試驗組的平均增重及飼料轉化率與對照組相比，分別提高了8.88%及2.55%（圖4A）。但是加魚用功能性卵黃粉前后試驗組與對照組的死亡率差別明顯，試驗組較對照組平均死亡率降低了38.8%。

圖4 福清某鰻鱺養殖場投喂魚用功能性卵黃粉養殖效果

3 討論

卵黃抗體作為飼料添加劑，在水產動物主要應用于鱉和蝦類上。李肖梁等[16]使用滅活的嗜水氣單胞菌卵黃抗體，添加到中華鱉飼料中發現，卵黃抗體組與對照組在日增重上差異顯著。雷勇[17]制備的抗白斑綜合征病毒（WSSV）卵黃抗體，能延緩螯蝦的死亡時間，使螯蝦死亡率從100%降至30%。而抗WSSV卵黃抗體對于提高對蝦免疫因子的活性，對于提高抗WSSV感染能力也有一定作用[18]。朱香萍等[19]制備的鰻弧菌卵黃抗體，對蝦鰻弧菌感染具有可靠的保護作用。

在本試驗中，通過ELISA和Western blot檢測，顯示制備的魚用功能性卵黃粉，抗體效價較高，特異性強。在攻毒試驗中，經過功能性卵黃粉投喂的鰻鱺攻毒存活率為77.8%，未投喂功能性卵黃粉的鰻鱺攻毒存活率僅44.4%，充分說明該功能性卵黃粉能夠增強鰻鱺抵抗嗜水氣單胞菌的侵染能力。

生長性能測定結果顯示，在鰻鱺飼料中添加0.3%的魚用功能性卵黃粉后，三組鰻鱺的增重和飼料轉化率較對照組均有上升（圖2～圖4）。其中在增重方面，長樂鰻鱺養殖場的結果最為明顯（42.9%），充分表明了魚用功能性卵黃粉對于鰻鱺生長的促進作用和其應用潛力。增重和飼料轉化率均提高的原因，一是魚用功能性卵黃粉所含的卵黃抗體本身作為優質蛋白源，被鰻鱺吸收后可促進飼料轉化率的提高[20]；二是卵黃抗體在腸道中能夠阻斷嗜水氣單胞菌對宿主腸黏膜的黏附作用，中和或抑制毒力因子對宿主細胞的致病作用[21]，從而減少了嗜水氣單胞菌等病菌對于其腸道侵擾的幾率，提高了腸道對于營養物質的吸收。而在死亡率上，福清鰻鱺養殖場在投喂魚用卵黃粉前后，試驗組和對照組兩者間的差別（圖4），也充分說明該卵黃粉中的抗體能有效增強魚體抗嗜水氣單胞菌等病菌的能力，從而提高魚體健康水平和養殖過程中的存活率。

4 結論

通過本文的研究，表明采用0.3%的功能性卵黃粉添加鰻鱺飼料，可有效降低嗜水氣單胞菌對于鰻鱺的侵染，降低鰻鱺的死亡率，并能提高生長性能。因此，其可用于嗜水氣單胞菌感染引起的鰻鱺疾病的預防和控制。雖然卵黃抗體在產品標準化等方面需要進一步加強[22]，但其作為新型飼料添加劑，將會成為抗生素和化學合成藥物的可能替代品，得到更大的研究和開發應用。