天津市監獄羈押人員中結核病患者臨床分離菌株的基因型分析

謝彤 王春花 趙慧 巨韓芳 穆成 王志銳 孫蕊

作者單位：300011 天津市疾病預防控制中心病原生物檢測所(謝彤、王志銳)；天津市結核病控制中心結核病參比實驗室(王春花、趙慧、巨韓芳、穆成、孫蕊)

全球范圍內不同國家結核病流行病學調查中監獄羈押人群的結核病發病率均明顯高于普通人群，其中監獄羈押人員中活動性肺結核平均發病率為普通人群的23倍[1]。結核分枝桿菌(MTB)在傳播過程中，經過長期進化已經形成多個不同的基因型，全球不同地區流行的MTB的主要基因型并不相同，其中北京基因型MTB是我國流行的主要基因型[2]。北京基因型菌株基因組核轉錄因子(nuclear transcription factors，NTF)區如果含有插入序列(IS)6110者則為北京基因型現代株，如果NTF區中IS6110缺失則為北京基因型古代株[3]。此外，根據北京基因型MTB在進化過程中會出現某些大片段的差異區域(regions of difference，RD)缺失，根據RD181、RD150和RD142的缺失情況，北京基因型菌株被分為4個不同進化分支[4]。鑒于監獄羈押人員為結核病的高發人群，筆者研究天津監獄羈押結核病患者中北京基因型MTB流行特征，以揭示菌株不同進化分支的傳播情況。

材料和方法

1.菌株來源：收集2013年1月至2016年6月從天津市監獄管理局羈押人員不同結核病患者痰標本中分離培養的124株分枝桿菌菌株，所有菌株均經過對硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼生化試驗鑒定證實為結核分枝桿菌復合群。實驗中所用的H37Rv標準菌株購自中國藥品生物制品所。

2.試劑和儀器：PCR擴增所用的Taq酶分別為2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司，北京)和Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix(NEB公司，北京)；溶菌酶、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等MTB基因組提取試劑購自美國Sigma公司。PCR擴增儀為德國Eppendorf公司生產；NanoDrop 2000超微量分光光度計為美國ThermoScientific公司生產。

3.MTB基因組提?。簩⑸L于改良羅氏培養基中的MTB菌落轉移至裝有磷酸鹽緩沖液(PBS)的1.5 ml Eppendorf管中，菌株經80 ℃水浴滅活后加入溶菌酶過夜消化，采用CTAB法提取MTB菌株的基因組DNA[5]。提取后的基因組DNA溶于1×TE緩沖液中，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定基因組含量。

4.基因型鑒定：基因組中RD207與RD105片段缺失是北京基因型MTB有別于其他基因型MTB的分子特征。采用多重PCR試驗，根據瓊脂糖凝膠電泳中擴增產物片段長度判定菌株基因組中RD207與RD105的缺失情況[5-6]。RD207缺失的MTB菌株PCR擴增產物長度為393 bp；RD207完整的MTB菌株PCR擴增產物長度為570 bp。RD105缺失的MTB菌株PCR擴增產物長度為547 bp；RD105完整的PCR擴增產物長度為330 bp。

5.基因組NTF區域IS6110分析：北京基因型菌株基因組NTF區IS6110插入序列的分析采用Wada等報道的方法[7]。使用MDR6和MDR6r擴增引物，通過PCR試驗分析菌株NTF區中是否存在IS6110序列。如果NTF區含有至少1個拷貝的IS6110序列，則為北京基因型現代株，其擴增產物長度為1.5 kb；反之則為北京基因型古代株，其擴增產物長度為302 bp。25 μl PCR反應體系中含有12.5 μl的Master Mix Taq酶，0.4 μmol/L的引物，以及10～50 ng基因組DNA。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。

6.MTB北京基因型菌株RD多態性分析：采用Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix Taq酶建立的多重PCR反應，分析MTB基因組中差異區域RD181、RD150與RD142的缺失情況，根據擴增產物長度判斷差異區域在菌株基因組中是否缺失。25 μl PCR反應體系中含有12.5 μl的Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix Taq酶，0.5 μmol/L的引物，以及10～50 ng基因組DNA。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。不同差異區域擴增引物序列參考Reed等[6]的報道。

結 果

1.基因分型：124株MTB菌株基因組中，同時發生RD105和RD207缺失的MTB有116株(93.5%)，均屬于北京基因型；8株(6.5%)為非北京基因型。

2.北京基因型菌株的進化分支：116株北京基因型MTB菌株中有20株(17.2%)基因組NTF區IS6110序列缺失，為北京基因型古代株；96株(82.8%)MTB基因組NTF區存在IS6110序列，為北京基因型現代株。

根據基因組中NTF區IS6110序列的存在情況和差異區域的多態性，北京基因型菌株被分為4個進化分支(表1)。菌株基因組中存在RD181差異區域的RD181(+)菌株被認為是北京基因型最早期的進化分支。在116株菌株中，RD181(+)的菌株為7株(6.0%)，均為NTF區不含IS6110插入序列的北京基因型古代株；RD181(-)的菌株為109株(94.0%)。在RD181(-)的菌株中，基因組NTF區無IS6110插入序列的北京基因型古代株有13株，占全部北京基因型菌株的11.2%；基因組NTF區存在IS6110插入序列的北京基因型現代株有96株，占全部北京基因型菌株的82.8%。96株北京基因型現代菌株中，95株基因組中有完整的RD150序列，占全部北京基因型菌株的81.9%，僅1株為RD150缺失的北京基因型現代株，占全部北京基因型菌株的0.9%。RD142差異序列存在于所有分析的北京基因型菌株基因組中。

討 論

北京基因型MTB在包括我國在內的東亞地區的流行最為廣泛，在臨床分離株中占絕對優勢，我國的東北、京津冀、河南等北方地區北京基因型MTB占臨床分離株的90%以上[8]。北京基因型MTB在俄羅斯、南非、東南亞、歐洲等多個國家和地區也同樣廣泛流行，是目前在全球傳播最廣的基因型[9]。本研究發現，北京基因型菌株在天津羈押人群中占臨床分離菌株的93.5%，與天津普通人群肺結核患者中北京基因型MTB的構成比相近[10]。

MTB的進化途徑主要是通過大片段的缺失、轉位及單核苷酸的突變[11]。其中在大片段進化路徑中MTB首先發生RD207與RD105缺失進化成為北京基因型；北京基因型MTB在以后的持續進化過程中，不同的菌株按順序可能出現RD181缺失、IS6110在NTF區的轉位插入形成現代株和RD150的缺失，從而形成不同MTB菌株大片段多態性[12-13]。本研究中，北京基因型現代株占全部北京基因型菌株的82.8%，說明天津監獄羈押人群結核病患者感染的菌株以北京基因型現代株為主；在天津地區普通人群中占86.5%[10]。提示天津地區普通人群與監獄羈押人群結核病患者感染的北京基因型菌株均以現代株為主?；仡櫺粤餍胁≌{查顯示，卡介苗(BCG)接種者中感染北京基因型現代株的結核病患者比例明顯高于未接種者，提示北京基因型現代株較該基因型的古代株更容易逃避BCG接種所產生的免疫，導致BCG的接種可能選擇性地促進MTB北京基因型現代株在人群中的傳播[14]。

注“+”表示序列完整；“-”表示序列缺失

基于菌株基因組中大片段多態性分析證實，天津監獄羈押人群中至少有4個北京基因型MTB進化分支流行，其中RD150(+)的北京基因型現代株占全部116株北京基因型菌株的81.9%，明顯高于其他3個北京基因型分支。天津地區普通人群中感染RD150(+)北京基因型現代株者占78.1%[10]，提示這一北京基因型進化分支無論是在普通人群中，還是監獄羈押人群中均為主要流行分支，而且在上述不同人群中肺結核患者感染RD150(+)北京基因型現代株的構成比相近。事實上，北京基因型在全球各地廣泛傳播流行也是由其現代株分支在人群的近期傳播所導致[15]。引起這一北京基因型現代株廣泛流行的機制還未完全闡明，采用小鼠肺感染模型對北京基因型不同進化分支菌株的毒性研究中證實RD150(+)北京基因型現代菌株較北京基因型古代株引發小鼠更快死亡，菌株對肺組織造成更大的病理損傷，提示這一進化分支具有更強的毒性[16]。在所有從天津監獄肺結核患者分離的菌株中，僅有1株北京基因型現代株中發生RD150差異區域的缺失，說明在RD150(-)北京基因型現代菌株在天津監獄羈押人群中并未廣泛流行，同時也提示RD150差異區域的缺失并不能促進北京基因型MTB在人群中傳播。雖然其他地區北京基因型菌株基因組中有RD142缺失的報道，但包括本研究在內我國不同地區基因大片段多態性對菌株進化研究中均未發現RD142缺失的北京基因型菌株，提示RD142差異區域在我國流行的北京基因型菌株中并不具備多態性。

綜上所述，北京基因型MTB是天津監獄羈押結核病患者感染的優勢菌株，至少發現4個北京基因型進化分支在監獄肺結核患者中流行；但結核病患者感染不同進化分支的比例存在較大的差異，RD150(+)北京基因型現代菌株是導致北京基因型在天津監獄羈押人員中傳播的主要分支，提示該進化分支較其他進化分支具有更強的毒性。今后在針對引起北京基因型廣泛傳播的分子機制研究中應重點對RD150(+)北京基因型現代這一分支開展研究，同時也十分有必要著重針對RD150(+)北京基因型現代菌株的流行開展監測。