氙氣預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞保護作用研究

朱 婧，郭建麗

1.陜西省人民醫院麻醉科(西安710068);2.內蒙古鄂爾多斯市中心醫院麻醉科(鄂爾多斯 017000)

急性心肌梗死是嚴重威脅人類健康及導致人類死亡的心血管疾病。介入、溶栓及搭橋術是目前臨床常用的治療急性心肌梗死的手段，可及時恢復病變區血流再灌注，挽救瀕死心肌細胞；然而缺血區血流再灌注有時會加速心肌死亡，擴大梗死區面積，引發心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。以往諸多研究顯示，MIRI不僅局限于局部組織，且會對遠隔器官組織造成影響，從而影響患者預后轉歸[1-3]。因此，如何預防MIRI及其對遠隔器官組織的影響成為目前國內外研究熱點。報道顯示，可通過抑制心肌缺血再灌注損傷機體心肌細胞凋亡及機體氧化應激反應等途徑，保護心肌細胞。近年來，多項研究顯示，麻醉藥物、尤其是吸入性麻醉藥物預處理MIRI具有很好的保護作用。氙氣是麻醉效果良好的理想型吸入惰性氣體。大量研究證實，氙氣預處理具有很好神經及心臟保護作用[4-5]。因此研究擬通過觀察氙氣預處理對MIRI大鼠心肌細胞凋亡和氧化應激反應的影響，探討氙氣對MIRI大鼠心肌細胞的保護作用及機制。

材料和方法

1 實驗材料 己糖激酶(K-H)液、0.5倍肺泡最小有效濃度(Minimum alveolar concentration，MAC)氙氣飽和K-H液，即40%氙氣+35%氮氣+25%混合氣體飽和K-H液、1 MAC即75% 氙氣+25%氧氣混合氣。成年雄性SD大鼠64只，體重265～350 g，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。采用隨機抽簽方式將其均分為四組，每組16只：假手術組(S組)、MIRI組(模型組)、0.5 MAC疝氣預處理+心肌I/R組(0.5 XR組)和1 MAC疝氣預處理+心肌I/R組(1 XR組)。

2 動物處理

2.1 MIRI模型制備：SD大鼠采用腹腔注射劑量為50 mg/kg的戊巴比妥鈉進行麻醉，待麻醉成功后將其固定于手術臺上，剪毛消毒后切開大鼠右頸，分離總動脈備用；切開暴露氣管組織，內置氣管套管，隨后連接動物呼吸機進行正壓通氣通氣(呼吸頻率約60～70次/min)，于其四肢皮下接通電極，與BL-420S型生物機能系統進行連接以持續記錄大鼠心電圖。在大鼠胸骨左緣部位做縱向切口，并在第5肋間開胸，打開大鼠心包，充分暴露心臟；之后采用6-0號無損傷縫合線在左耳下緣2 mm處穿過左冠狀動脈前降支，使心肌缺血30 min，松開結扎線后再灌注120 min。MIRI模型制備成功的標注為：缺血時局部心肌組織呈蒼白、發紺狀，心電圖監測顯示ST段明顯抬高或出現T波高聳；缺血區在出現血流再灌注后心肌組織轉紅，心電圖監測中所出現的明顯抬高的ST段下降50%以上。

2.2 實驗處理：S組大鼠開胸后至穿線不進行左冠狀動脈前降支的結扎，持續150 min；模型組則在結扎左冠狀動脈前降支使心臟缺血30 min后，松開結扎線使血流再灌注120 min；0.5 XR組采用0.5 MAC氙氣預處理60 min，分4個循環，每個循環用含有0.5 MAC氙氣的K-H液灌注5 min，然后再用純K-H液進行10 min的洗脫，4個循環結束后進行左冠狀動脈前降支的結扎缺血處理30 min，復灌注120 min；1 XR組則使用1 MAC氙氣的K-H液進行預處理，預處理過程同0.5 XR組。

3 觀察指標

3.1 心肌梗死面積評估：再灌注結束，每組取4只大鼠阻斷左冠狀動脈前降支，通過頸內靜脈注射伊文斯藍，心肌正常區發生藍染，快速取出心臟并分離出左心室，并將心室橫斷成2 mm厚的組織塊；同時分離出正常的藍染組織。將未發生染色的危險區組織置于0.5%TPT中，并于37℃條件下水浴處理15 min，10%福爾馬林進行24 h固定。梗死區則發生染色呈現灰白色，于顯微鏡下對其進行切割稱重。心肌梗死范圍=梗死區心肌質量/危險區心肌質量×100%

3.2 心肌細胞凋亡：再灌注結束，每組取4只大鼠處死，快速切除心臟并分離出左心室。使用細胞凋亡測定試劑盒測定心室內凋亡心肌細胞數量，細胞核為藍色的屬于正常細胞，棕黃色為凋亡陽性細胞。標本切片于400倍鏡下隨機取5個視野進行細胞計數。心肌細胞凋亡指數為凋亡細胞總數占總細胞數的百分比。

3.3 血清生化指標：再灌注120 min后取4只大鼠，經腹部取其主動脈血樣5 ml， 3000 r/min條件下，4℃冷凍離心15 min，獲得血清-20℃保存用于測定血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、一氧化氮合酶(eNOS)活性。CK、CK-MB、eNOS測定均選擇免疫熒光法，其中CK、CK-MB試劑盒基蛋生物科技股份有限公司，eNOS試劑盒購自于南京信帆生物技術有限公司。

3.4 氧化應激指標：再灌注結束，每組4枚心臟中取其左室固定部位心肌組織0.5 cm×0.5 cm×1 cm，做勻漿處理，取10%的勻漿液置于4℃低溫離心機中進行離心，2000 r/min條件下離心8 min。采用黃嘌呤氧化酶法測定心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性，選擇硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)采用雙抗體夾心法測定。所用試劑盒均購自于上海紀寧實業有限公司。

結 果

1 四組大鼠再灌注120 min后心肌梗死范圍和細胞凋亡指數對比 見表1。與S組相比，模型組心肌梗死范圍明顯增大，心肌細胞凋亡指數顯著升高(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌梗死范圍顯著縮小，心肌細胞凋亡指數顯著下降(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌梗死范圍和心肌細胞凋亡指數間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 四組大鼠再灌注120min后心肌 梗死范圍和細胞凋亡指數對比(%)

注：與對照組比， *P<0.01；與模型組比，#P<0.05

2 四組大鼠心肌組織中SOD、MDA、GSH-PX含量對比 見表2。與S組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD、GSH-PX含量顯著減少，MDA含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠SOD、GSH-PX含量顯著增加，MDA含量顯著下降(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌組織中SOD、MDA、GSH-PX含量間差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 四組大鼠心肌組織中 SOD、MDA、GSH-PX含量比較

注：與對照組比，*P<0.01；與模型組比，#P<0.05

3 四組大鼠再灌注120 min后血清CK、CK-MB、eNOS活性對比 見表3。與S組相比，模型組大鼠血清CK、CK-MB活性顯著增強，eNOS活性顯著下降(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠CK、CK-MB活性顯著降低，eNOS活性顯著增強(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠血清CK、CK-MB、eNOS活性間差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 四組大鼠再灌注120min后血清 CK、CK-MB、eNOS活性對比

注：與對照組比， *P<0.01；與模型組比，#P<0.05

討 論

MIRI是一個涉及細胞凋亡、氧化自由基產生、諸多炎癥介質和免疫因子釋放等過程的復雜性病理反應。缺血再灌注后抗氧化物質大量消耗，氧自由基等毒性產物大量積累，破壞心肌細胞結構，激活機體炎癥反應，造成心肌進一步損傷，最終導致心肌細胞凋亡加速，梗死范圍擴大。預先對臟器做短暫的缺血再灌注處理后，通過調節機體炎癥介質釋放，激活神經傳導通路等，可提高器官組織的抗MIRI能力，此方法即為缺血預處理。目前，缺血預處理被認為是臨床中有效的內源性保護機制。許多實驗證實，揮發性麻醉藥物預處理具有一定器官組織保護作用。

氙氣臨床特性接近理想型吸入麻醉藥物，其血氣分配系數較低，因此對心血管系統的抑制作用相對較小。賈平等研究顯示，不同時相氙氣預處理均可降低腎臟缺血再灌注損傷[6]。眾所周知，miRNA參與多種器官IRI的發展和缺血預處理的保護作用。Jia通過miR-21體內敲除和miR-21靶通路分析來確定氙氣預處理對于腎臟IRI的保護作用，結果發現氙氣預處理2 h可對腎臟IRI提供形態學和功能性保護作用[7]；Li等研究表明，75%氙氣預處理可可通過阻斷IRI引起的線粒體結構改變，開放mitoKATP通道，從而顯著改善兔模型心功能，縮小其心肌梗死面積，減少細胞凋亡，抑制CK-MB釋放[8]；Liu等發現，氙氣處理通過激活AKT和ERK信號通路，減輕大鼠脊髓IRI程度[9]。IRI會導致心肌組織細胞中SOD、GSH-PX等自由基清除酶含量下降，導致機體氧自由基大量堆積；進一步脂質過氧化反應導致機體MDA含量增加；eNOS為調節NO合成的限速酶，NO具有擴張血管、抑制炎癥細胞功能，改善冠脈血液供應的內源性信號分子，具有很好的保護心肌內皮細胞的功效[10]。同時，心肌缺血還會對細胞膜造成損傷，使得通透性增加，從而導致CK、CK-MB釋放至血液，因此血清中CK、CK-MB含量也是反應心肌細胞損傷程度的良好指標。本研究選擇阻斷左冠狀動脈前降支的方式造成大鼠缺血30 min，之后恢復灌注120min獲得MIRI模型。研究結果顯示，與S組比，模型組心肌梗死范圍顯著增加，心肌細胞凋亡指數明顯升高，心肌組織中SOD、GSH-PX和血清eNOS活性顯著下降，MDA含量顯著增加，血清CK、CK-MB活性顯著增強，提示MIRI模型制備成功。筆者在預實驗基礎上，參照文獻選擇0.5 MAC氙氣和1MAC氙氣進行預處理。結果提示氙氣可通過抑制大鼠MIRI后氧化應激反應，抑制心肌組織進一步損傷。但0.5 XR組和1 XR組大鼠各指標間差異無統計學意義。

綜上所述，氙氣預處理可通過抑制大鼠機體氧化應激反應，減少心肌細胞凋亡數目及心肌梗死面積，降低CK及CK-MB釋放，從而達到保護心肌細胞的預處理功效。但加大氙氣使用百分比后對心肌細胞保護作用有限。