新疆地區綿羊品種TMEM154基因第2外顯子G103A位點的多態性分析

陳 磊,劉書東,倪文浩,賀三剛,李文蓉

(新疆畜牧科學院 生物技術研究所，農業部草食家畜繁育生物技術重點開放實驗室，新疆維吾爾自治區動物生物技術重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830000)

梅迪-維斯納病是由綿羊進行性肺炎病毒引起的成年綿羊的慢性接觸性傳染病[1-3]，該病以中樞神經系統、肺和流向這些組織的淋巴結的單核細胞浸潤為特征[4-5]，給養羊業造成不同程度的經濟損失。近期的研究發現，綿羊跨膜蛋白154基因(Transmembrane protein 154，TMEM154)第2外顯子G103A(E35/K35)位點的多態性與進行性肺炎的發生密切相關，TMEM154蛋白第35位氨基酸(E35)為谷氨酸時綿羊對進行性肺炎病毒具有易感性，而為賴氨酸(K35)時綿羊對該病毒表現為抗性[6-7]。與此同時，Heaton等[8]研究也發現，攜帶單拷貝E35等位基因的綿羊進行性肺炎的易感風險比非攜帶者高2.85倍。此外，鑒于綿羊進行性肺炎在所有養羊國家或地區均發生過大規模的流行[9-11], Heaton等[12]對來自多個國家的74個品種2 819只綿羊的TMEM154基因多態性分析發現，與綿羊進行性肺炎病毒易感相關的TMEM154基因E35等位基因頻率在上述綿羊群體中達到51%，說明多數綿羊品種對進行性肺炎普遍易感。由此可知，提高綿羊群體中TMEM154 K35等位基因頻率，降低或消除易感性強的E35等位基因頻率，能夠為有效控制綿羊進行性肺炎病毒的傳播發揮重要作用。雖然國外研究人員對不同品種綿羊TMEM154基因的多態性與綿羊進行性肺炎易感性/抗性進行了研究[1，13-15]，但目前尚未開展新疆地方綿羊品種TMEM154基因的遺傳多態性分析，TMEM154基因與新疆地方綿羊品種進行性肺炎的易感性/抗性的遺傳規律亦尚未闡明。因此，開展新疆地方品種綿羊TMEM154基因多態性的研究，能夠有效預防和控制綿羊進行性肺炎病毒在新疆地區的傳播。本研究分析了新疆地區8個綿羊品種TMEM154基因第2外顯子G103A(E35/K35)位點的基因多態性，明確新疆地區主要綿羊品種TMEM154基因的多態性以及對綿羊進行性肺炎的抗性和易感性基因型分布規律，從而為從遺傳學方面控制新疆主要地方綿羊品種進行性肺炎的傳播提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇新疆地區6個地方綿羊品種(阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊)和2個培育品種(中國美利奴羊和德國美利奴羊)共520只綿羊個體為試驗材料(表1)，采集綿羊頸靜脈全血或耳組織，EDTA抗凝，-20 ℃保存備用。

表1 樣本來源

1.2 主要試劑

2×TransTaq-T PCR SuperMix和100 bp DNA Ladder購自北京全式金生物技術有限公司；膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Tris平衡酚購于北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為分析純產品。

1.3 血液或耳組織DNA提取

采用酚/氯仿法提取綿羊血液或耳組織DNA，利用Nano Drop 2000核酸分析儀檢測提取的綿羊血液和耳組織樣本DNA的濃度和純度，然后使用0.8%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，最后將抽提好的樣本DNA用ddH2O逐一稀釋至終濃度為100 ng/μL，置于-20 ℃保存備用。

1.4 引物設計及PCR擴增

利用Oligo 7.0軟件對GenBank 上發表的綿羊TMEM154基因序列(GenBank 登錄號: NC_019474.1)存在堿基變化的外顯子區域設計引物，上游引物: 5′-gcctttgtgggagattta-3′;下游引物: 5′-aattttggaaaatgtcactga-3′, 預期擴增片段為745 bp,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR 擴增體系(50 μL): 2×TransTaq-T PCR SuperMix 25 μL , 上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA 模板1 μL,ddH2O 補至50 μL。PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 35 個循環后 72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。吸取5 μL PCR 產物用1%的普通瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并將純化后的PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.5 數據分析

根據PCR產物的測序結果，分析和計算TMEM154基因第2外顯子G103A位點在新疆地區8個綿羊品種中的基因型和等位基因頻率；利用χ2檢驗分析是否符合Hardy-Weinberg 平衡定律；根據分析獲得的TMEM154第2外顯子G103A位點的基因型，將新疆地方綿羊品種分為對進行性肺炎具有易感性與抗性兩類，然后進行等位基因頻率G/A比值與綿羊進行性肺炎易感性的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增

以綿羊的基因組DNA為模板進行PCR反應，擴增獲得含有TMEM154基因第2外顯子G103A位點的特異性目的片段，該片段與預期片段745 bp，其電泳結果如圖1所示。

圖1 綿羊TMEM154第2外顯子G103A位點PCR擴增結果M.DNA marker 100 bp；1-4.PCR 產物

2.2 TMEM154基因第2外顯子G103A位點的PCR測序分析

利用PCR測序法分別對阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊、巴什拜羊、德國美利奴羊和中國美利奴羊等8個綿羊品種的TMEM154基因第2外顯子G103A位點進行檢測，共發現3種不同的基因型：AA、AG和GG(圖2)。中國美利奴羊、德國美利奴羊和哈薩克羊群體均檢測出3種基因型，阿勒泰羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊缺少AA基因型。

圖2 TMEM154基因第2外顯子103位點測序分析

2.3 G103A位點的基因頻率和基因型頻率以及群體遺傳學分析

如表2所示，新疆地區6個地方綿羊品種中阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊群體TMEM154基因第2外顯子103位點以GG為主要基因型，同時AG基因型在阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊中的基因型頻率分別為11.00%、22.00%、6.00%、8.00%、11.00%和20.00%；而AA基因型在哈薩克羊群體中比率僅為1.70%，阿勒泰羊、多浪羊、策勒黑羊、巴什拜羊和巴音布魯克羊群體中沒有檢測出AA基因型，因此阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊是進行性肺炎高敏感的綿羊品種。在中國美利奴羊和德國美利奴羊群體中AA基因型為優勢基因型，頻率分別達到63.00%和52.00%，AG基因型頻率分別為29.00%和24.00%，中國美利奴羊GG基因型頻率最低僅為8.00%，由此可知，中國美利奴和德國美利奴是進行性肺炎低敏感綿羊品種。等位基因分析發現：在中國美利奴羊群體中，與進行性肺炎抗性相關A等位基因頻率高達0.78，G等位基因頻率僅為0.22。

2.4 TMEM154基因第2外顯子G103A位點等位基因頻率比值與進行性肺炎易感性的相關性分析

如圖3所示，等位基因G/A的比值可能與綿羊品種進行性肺炎易感性呈正相關。進行性肺炎高敏感的巴音布魯克羊等位基因G/A的比值為30.25，而進行性肺炎低敏感的中國美利奴羊等位基因G/A的比值僅為0.29，這兩個實驗群體等位基因G/A的比值相差約104.31倍以上。進行性肺炎高敏感的阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊群體與進行性肺炎低敏感的中國美利奴羊和德國美利奴羊群體之間等位基因G/A的比值呈現顯著差異，說明進行性肺炎高敏感的綿羊品種與進行性肺炎低敏感的綿羊群體間基因型頻率存在明顯差異。

表2 不同基因型頻率和等位基因頻率

圖3 G103A位點基因頻率G/A比值
注：*表示差異顯著(P<0.05)。

Fig.3 G/A ratio of G103A locus alleles frequency
Note: * indicates significant difference (P<0.05).

3 討 論

綿羊進行性肺炎在新疆各地、州和種羊場均曾廣泛傳播，給養羊業造成巨大的經濟損失。該病在動物疫病中屬于2類疫病，綿羊感染后表現為慢性、進行性、間質性肺炎，最后因器官衰竭、缺氧導致綿羊死亡[16-17]。Heaton等[8]研究發現，不同的綿羊品種和不同的年齡階段，綿羊進行性肺炎陽性分布率及發生均存在顯著的差異。此外，研究人員在對綿羊進行性肺炎研究及防治過程中發現，不同品種綿羊對進行性肺炎病毒易感性存在差異，究其實質可能與不同綿羊品種的遺傳背景存在差異有關。因此，從分子水平深入研究綿羊進行性肺炎發生的分子機制與調控機理，尋找影響綿羊進行性肺炎發生的關鍵基因或分子標記，對新疆乃至全國優秀地方品種綿羊的抗病育種尤為關鍵。

分子標記輔助選擇技術已經在動、植物優良性狀的輔助選擇育種中得到廣泛的應用[18-22]，該技術能夠準確地分析個體遺傳組成，實現對基因型的直接選擇并進行分子育種。本研究對新疆地區主要綿羊品種TMEM154基因的多態性以及對綿羊進行性肺炎的抗性和易感性基因型分布規律開展研究。結果發現，新疆8個地方綿羊品種TMEM154基因第2外顯子G103A多態性位點的基因型頻率和等位基因頻率均存在較大差異，χ2檢驗結果表明，阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊在G103A位點均偏離了Hardy-Weinberg平衡規律(P>0.05)(表2)，推測阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊可能受到基因突變、遷移、自然選擇等因素的影響，符合新疆當地純種阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊雜交數量增多這一情況。同時，分析發現與綿羊進行性肺炎易感相關的GG基因型在阿勒泰羊、哈薩克羊、多浪羊、巴音布魯克羊、策勒黑羊和巴什拜羊等新疆地方綿羊品種中屬于優勢基因型，而在中國美利奴羊和德國美利奴羊群體基因型頻率較低，而與綿羊進行性肺炎抗性相關的AA基因型在這8個綿羊群體中的分布情況與GG基因型剛好相反。此外，本研究還發現，哈薩克羊、德國美利奴羊和中國美利奴羊群體中AG基因型頻率較高，這可能是由于哈薩克羊、德國美利奴羊和中國美利奴羊群體在本地區的品種改良過程中引入其他綿羊品種基因所導致。

TMEM154基因位于綿羊第17號染色體，具有7個外顯子，編碼191個氨基酸，綿羊TMEM154基因與人、鼠和牛序列具有67.3%、53.8%和92.5%的相似性[8]。目前的研究表明，該基因與人類和動物相關疾病的發生過程具有一定的相關性。在對人類的研究中發現，TMEM154基因的表達與哮喘病發生的嚴重程度緊密相關，在呼吸系統中該基因的功能具有很強的保守性[14]；同時，TMEM154基因在小鼠組織表達譜的分析結果發現，該基因僅在乳腺組織中特異性表達，但其作用機制尚未可知[23]；此外，對綿羊TMEM154基因部分敲除試驗發現，TMEM154基因的功能性缺失可以提高綿羊對進行性肺炎的抗病性[8]。本實驗室對巴音布魯克和中國美利奴羊開展重測序技術，利用FST的方法亦篩選獲得收到選擇的TMEM154基因，從而為本研究的開展提供有利的佐證。目前，盡管發現TMEM154基因與綿羊進行性肺炎的易感性相關，但對該基因在進行性肺炎病毒感染過程中的作用機制仍待進一步深入研究，因此后續通過增加不同品種綿羊群體數、擴大樣本量，深入開展該SNP位點與綿羊進行性肺炎易感性的相關性分析，將為利用該SNP位點進行分子標記輔助選擇育種具有一定的理論指導和實踐意義。

4 結 論

TMEM154基因第2外顯子G103A SNP位點的GG基因型在阿勒泰羊、哈薩克羊、多浪羊、巴音布魯克羊、策勒黑羊和巴什拜羊群體中屬于優勢基因型，而在中國美利奴羊和德國美利奴羊群體中該基因型頻率僅分別為8.00%和24.00%。進行性肺炎高敏感的阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊群體G103A位點的基因型頻率和進行性肺炎低敏感的中國美利奴羊和德國美利奴羊存在顯著差異，等位基因頻率A/G與進行性肺炎密切相關。由于該位點SNP與進行性肺炎易感性具有較強的相關性，因此可以作為新疆乃至全國進行性肺炎易感性綿羊品種的候選分子標記。