響應面法優化多黏類芽孢桿菌BD3736發酵脫脂乳產α-葡萄糖苷酶抑制劑的工藝條件

馮華峰

（光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海乳業生物工程技術研究中心，乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436）

糖尿病是一種以高血糖為特征的內分泌代謝疾病，由于口服降糖藥使用方便、價格相對便宜，大部分患者更愿意接受。以α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）為靶標的口服降糖藥能有效控制餐后血糖波動，目前是我國治療糖尿病的一線藥物[1]。α-葡萄糖苷酶抑制劑（α-glucosidase inhibitors，AGIs）通過競爭性抑制小腸α-葡萄糖苷酶的活性，來延緩腸道對碳水化合物的消化與吸收，降低餐后血糖水平并抑制過多的胰島素分泌，最終達到控制血糖的目的[2]。

目前，阿卡波糖（Acarbose）是臨床上最常用的AGIs類藥物之一，是由游動放線菌（Actinoplanes）SE50/110規?；l酵獲得的偽寡糖[3]。米格列醇（Miglitol）作為1-脫氧野尻霉素（1-desoxynojirimycin，DNJ）的衍生物，是首個假單糖類的AGIs，也是臨床上常用的AGIs類藥物[4]。在臨床使用過程中，上述2 種藥物均會有胃腸道不適、過敏和肝損傷等不良反應[5]。因此，篩選和設計新型的AGIs仍是當前口服降糖藥的開發熱點之一[6-8]。

根據目前報道，在各種微生物的次生代謝產物中篩選新型AGIs仍是研究首選，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）逐漸被人們所重視。Yamada等[9]從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）G45C的次級代謝產物中檢測出能夠抑制小腸α-葡萄糖苷酶活性的羥基檸檬酸。Abd El-Hady等[10]從海綿中分離出芽孢桿菌，并在培養液中分離出二酮哌嗪（diketopiperazines），其對α-葡萄糖苷酶的抑制能力超過阿卡波糖。Nguyen等[11]將類芽孢桿菌TKU042菌株的發酵產物經多步分離純化后，發現類芽孢桿菌的次級代謝產物高龍膽酸（homogentisic acid）具有很強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其半數最大抑制質量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.22 mg/mL，最大抑制率為95%，而阿卡波糖的IC50為1.51 mg/mL，最大抑制率為65%。

多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是類芽孢桿菌屬的模式菌種，其代謝產物中含有多種可被利用的生物活性物質，主要包括脂肽、蛋白水解酶、胞外多糖和植物激素等[12-14]。本實驗室從江南傳統泡菜中分離篩選出一株多黏類芽孢桿菌BD3736[15]。本研究以脫脂乳為發酵介質，對多黏類芽孢桿菌BD3736高效合成AGIs的條件與特性進行研究，旨在為此領域的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：多黏類芽孢桿菌BD3736（P. polymyxaBD3736），其在中國普通微生物菌種保藏中心的編號為CGMCC10062，由乳業生物技術國家重點實驗室提供。

脫脂乳粉 新西蘭恒天然集團；α-葡萄糖苷酶（E.C 3.2.1.20，源自酵母）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）和阿卡波糖 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；GNP-9270隔水恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；PB-100 pH計 德國Sartorius公司；HZQ-X500C大型恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；Spectra Max M5多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；Millipore-Q超純水儀 德國默克-密理博公司；Biofuge Strators高速冷凍離心機 德國Heraeus公司；FreeZone凍干機 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基的配制

菌株活化和活菌計數培養基的配制：配制20 mL質量濃度10 g/100 mL的脫脂乳液體培養基，再取1.4 g瓊脂粉溶于80 mL水中，分別于115 ℃滅菌15 min取出，待冷卻至60 ℃時，將二者混勻，倒入無菌平板中，配成質量濃度2 g/100 mL的脫脂乳瓊脂平板。

種子和發酵培養基的配制：配制質量濃度8 g/100 mL的脫脂乳液體培養基，于115 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

1.3.2 多黏類芽孢桿菌BD3736種子液的制備

將多黏類芽孢桿菌BD3736凍存管從超低溫冰箱中取出，劃線于質量濃度2 g/100 mL的脫脂乳瓊脂平板中，30 ℃好氧培養2 d；活化2 代后，挑取單菌落，接種于質量濃度8 g/100 mL的脫脂乳液體培養基中（裝量為20 mL/100 mL三角瓶），30 ℃、180 r/min振蕩培養2 d后，將發酵液10 000×g離心20 min，棄上清，取菌體用無菌水清洗2 次，以去除殘留的培養基，最后將菌體懸浮于少量質量濃度8 g/100 mL脫脂乳液體培養基中，調整其活菌數為109CFU/mL作為種子液，備用。

1.3.3α-葡萄糖苷酶抑制率及IC50的測定

用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.80）溶解或稀釋待測樣品，取100 μL于1.5 mL離心管，加入50 μL 100 mU/mLα-葡萄糖苷酶，混勻，37 ℃溫育15 min，再加入80 μL 2.0 mmol/L的pNPG，混勻，37 ℃反應15 min，最后加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應，10 000×g離心2 min，取200 μL上清于96孔板中，于405 nm波長處測定吸光度（A）。

同時，為避免脫脂乳本身對α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型的影響，本研究采用無菌脫脂乳（質量濃度8 g/100 mL）上清作為陰性對照。制備方法如下：用乳酸將已滅菌的脫脂乳（質量濃度8 g/100 mL）pH值調節至與待測發酵樣品相同，10 000×g離心2 min后取上清，用1.0 mol/L NaOH調節pH值至6.80，再次10 000×g離心2 min后取上清，即得陰性對照組。取3 次平行實驗的平均值，按照下式計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率。以質量濃度1.0 mg/mL的阿卡波糖作為陽性對照。

式中：陰性對照為用無菌脫脂乳替代待測樣品；陰性空白為用PBS替代陰性對照組中的α-葡萄糖苷酶；樣品空白為用PBS替代待測樣品組中的α-葡萄糖苷酶。

IC50的測定：以倍半稀釋的方法將待測樣品溶液進行稀釋，獲得不同質量濃度的待測樣品，利用上述檢測方法測定不同質量濃度的待測樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率，根據質量濃度與α-葡萄糖苷酶抑制率的線性關系，計算得出樣品對α-葡萄糖苷酶的IC50。

1.3.4 多黏類芽孢桿菌BD3736在脫脂乳中的生長情況測定

將多黏類芽孢桿菌BD3736劃線于脫脂乳瓊脂平板（質量濃度2 g/100 mL）上，觀察菌株生長特性。

將多黏類芽孢桿菌BD3736以2%（V/V，下同）的接種量接種于質量濃度8 g/100 mL的脫脂乳液體培養基中（裝量為100 mL/250 mL三角瓶），在180 r/min、30 ℃條件下振蕩培養，分別于0、3、6、9、12、24 h及2、3、4、5、6、7 d，測定發酵體系pH值和活菌數，并觀察不同培養時間（1、3、5 d）的發酵液顏色。

取培養2 d的發酵乳樣品，10 000×g離心20 min，取上清，在沸水浴中加熱滅活15 min后，冷卻至室溫；用1.0 mol/L NaOH調節pH值至6.80，再次10 000×g離心20 min，取上清，并測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率和IC50。

1.3.5 不同因素影響AGIs產量的單因素試驗設計

1.3.5.1 接種量對AGIs產量的影響

將多黏類芽孢桿菌BD3736種子液分別以1%、2%、3%、5%、8%和10%的接種量接入質量濃度8 g/100 mL的脫脂乳發酵培養基中（裝量為100 mL/250 mL三角瓶），30 ℃、180 r/min振蕩培養2 d；實驗結束后，按照1.3.4節所述方法對發酵液進行后處理，再按照1.3.3節所述方法測定不同接種量樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率（n=3）。

1.3.5.2 發酵溫度對AGIs產量的影響

將多黏類芽孢桿菌BD3736種子液以2%的接種量接入質量濃度8 g/100 mL的脫脂乳發酵培養基中（裝量為100 mL/250 mL三角瓶），分別置于28、30、32、34、37、40 ℃，180 r/min振蕩培養2 d；實驗結束后，按照1.3.4節所述方法對發酵液進行后處理，再按照

1.3.3節所述方法測定不同發酵溫度樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率（n=3）。

1.3.5.3 培養時間對AGIs產量的影響

將多黏類芽孢桿菌BD3736種子液以2%的接種量接入質量濃度8 g/100 mL的脫脂乳發酵培養基中（裝量為100 mL/250 mL三角瓶），于30 ℃、180 r/min振蕩培養1、2、3、4、5、6、7 d；實驗結束后，按照1.3.4節所述方法對發酵液進行后處理，再按照1.3.3節所述方法測定不同培養時間樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率（n=3）。

1.3.5.4 脫脂乳質量濃度對AGIs產量的影響

將多黏類芽孢桿菌BD3736種子液以2%的接種量分別接入脫脂乳質量濃度為2、4、8、10、12 g/100 mL的發酵培養基（裝量為100 mL/250 mL三角瓶），30 ℃、180 r/min振蕩培養2 d；實驗結束后，按照1.3.4節所述方法對發酵液進行后處理，再按照1.3.3節所述方法測定不同質量濃度脫脂乳樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率（n=3）。

1.3.6 響應面優化影響AGIs產量的因素

對上述單因素試驗結果進行顯著性分析，選取3 個最顯著的影響因素，以AGIs對α-葡萄糖苷酶的IC50為響應值（減少抑制活性水平較高時的誤差），設計響應面試驗（n=3）。

1.4 數據處理

實驗數據采用Design Expert 8.0軟件和SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和Student’st檢驗，P＜0.05（P＜0.01）為有統計學顯著（極顯著）差異；采用GraphPad Prism 8.0軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 多黏類芽孢桿菌BD3736在脫脂乳中的生長情況

由圖1A可知，隨著培養時間的延長，多黏類芽孢桿菌BD3736發酵體系顏色逐漸加深。這是由于發酵體系中含有大量氨基酸、肽和蛋白質，與乳糖、半乳糖和葡萄糖等還原性糖發生美拉德反應（又稱“非酶褐變”）所造成的[16]。發酵體系的顏色越深，代表多黏類芽孢桿菌BD3736對乳蛋白和乳糖的水解程度越深。

由圖1B可知，多黏類芽孢桿菌BD3736菌落周圍呈現澄清、透明的乳蛋白水解圈，表明多黏類芽孢桿菌BD3736具有很強的乳蛋白水解能力，這種發酵特性被發現于多種類芽孢桿菌中。Li Yunxia等[17]從桂皮類芽孢桿菌（Paenibacillus lautus）CHN26中克隆并異源過量表達出一種由466 個氨基酸組成、分子質量為51.94 kDa的羧基末端蛋白酶；Hang Feng等[18]則從一株類芽孢桿菌新種牛類芽孢桿菌（Paenibacillus bovis）BD3526中分離獲得一種新型、高效、性能穩定的金屬蛋白酶（分子質量35 kDa）；另外，牡丹類芽孢桿菌（Paenibacillus peoriae）[19]以及幼蟲類芽孢桿菌（Paenibacillus larvae）[20]等均有相關報道，因此，蛋白質水解能力是大部分類芽孢桿菌的常規特性。

由圖1C可知，多黏類芽孢桿菌BD3736接種于發酵培養基后的2 d內，其活菌數逐漸增長，直至達到峰值1.0×109CFU/mL之后，開始緩慢下降，這可能是由于發酵體系中營養物質的匱乏或部分不利于菌體生長的代謝產物過度積累。發酵終點（7 d）時，活菌數降至2.0×106CFU/mL。發酵體系pH值的快速下降在菌體快速增長階段表現最明顯，發酵前2 d內，pH值由接種時的6.40下降至5.76，隨后以每天0.05～0.10的速率緩慢下降至發酵終點（pH 5.40）。與乳酸菌不同的是，類芽孢桿菌發酵體系中pH值的下降不僅得益于乳糖代謝所合成乳酸的貢獻，而且與菌株分泌的多種乳蛋白水解酶將酪蛋白水解成偏酸性的肽和氨基酸有關。

經測定，接種多黏類芽孢桿菌BD3736發酵2 d的脫脂乳上清的α-葡萄糖苷酶抑制活性明顯，對α-葡萄糖苷酶的抑制率為53.8%，IC50為47.4 mg/mL。

2.2 多黏類芽孢桿菌BD3736產AGIs的單因素試驗結果

2.2.1 接種量對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

發酵體系種子的接種量會直接影響發酵液中的初始活菌數，從而影響整個發酵過程中代謝產物的合成與積累速率。由圖2可知，當接種量較低時（1%、2%、3%），發酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果與接種量呈正相關，當接種量為3%時，α-葡萄糖苷酶的抑制率達到極值，為64.3%。但進一步提高接種量并未有效提高發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性，相反地，抑制效果隨著接種量提高呈明顯下降趨勢。這可能是由于接種量過高時，過多的營養物質被消耗用于菌體增殖，使菌體代謝產物總量降低，最終造成AGIs合成與積累受到限制。因此，優選的發酵接種量為3%。

2.2.2 發酵溫度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

溫度是影響酶活性的重要外因，通過對溫度的調控可以有效控制菌體的各種相關生命活動，只有適宜的溫度環境才能使微生物的生長和代謝過程更高效、有序。由圖3可知，當發酵溫度過低（28 ℃）或過高（40 ℃）時，發酵液中AGIs含量相對偏低，α-葡萄糖苷酶抑制率分別為33.3%和21.0%。前者的成因可能是低溫條件下菌體代謝能力不足，后者的成因則可能是高溫條件加速菌體衰亡，二者均直接導致AGIs產量驟降。而在30～37 ℃條件下，發酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率均達50%以上，32 ℃條件下，發酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高（75.6%）。因此，選取32 ℃作為多黏類芽孢桿菌BD3736發酵產AGIs的最佳溫度。

2.2.3 培養時間對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

由圖4可知，在多黏類芽孢桿菌BD3736接種后的前4 d里，發酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸上升，直至第4天達到相對峰值（87.3%），此后，隨著發酵時間的延長，盡管α-葡萄糖苷酶抑制率略有升高，但與第3天相比無顯著性差異，因此，從時間成本考慮，選擇4 d為較適培養時間。

2.2.4 脫脂乳質量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

在本研究的發酵體系中，脫脂乳是多黏類芽孢桿菌BD3736唯一的營養來源，因此，選擇合適質量濃度的脫脂乳有利于多黏類芽孢桿菌BD3736快速、高效地合成AGIs。由圖5可知，采用不同質量濃度（2、4、8、10、12 g/100 mL）脫脂乳制備的發酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為17.3%、38.3%、54.8%、57.8%和60.6%。發酵液中AGIs的產量隨著脫脂乳質量濃度的增加而增加，在8 g/100 mL以下的較低質量濃度時，抑制效果隨著脫脂乳質量濃度的增加明顯增加，繼續增加脫脂乳質量濃度并未顯著提升發酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率，這可能是由于固定接種量的多黏類芽孢桿菌BD3736的代謝能力相對有限，無法將生長環境中充足的營養物質有效轉化與利用，另外，高質量濃度脫脂乳的滲透壓往往偏高，不利于菌體的正常生長與增殖。同時，為了后續對發酵乳中AGIs分離純化的要求，選擇8 g/100 mL作為脫脂乳培養基的質量濃度。

2.3 AGIs產量的響應面優化試驗結果

2.3.1 響應面優化試驗設計及結果

將上述單因素（接種量、發酵溫度、培養時間及脫脂乳質量濃度）優化結果經SPSS 17.0軟件分析發現，接種量、發酵溫度和培養時間的P值均小于0.05，因此選取接種量、發酵溫度和培養時間3 個顯著因素，以IC50為響應值，采用3因素3水平的響應面優化試驗進行進一步優化。響應面優化試驗設計及結果如表1～2所示。

表 1 Box-Behnken試驗設計因素水平及編碼Table 1 Factors and their coded levels used for Box-Behnken design

表 2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

2.3.2 響應面優化試驗結果分析

將表2的數據通過Design Expert 8.0軟件進行回歸擬合，得多元二次響應面回歸模型：IC50=30.50-7.88A-2.75B-3.63C-0.25AB＋1.00AC-0.75BC＋28.75A2＋10.50B2＋12.75D2。該模型的R2=0.868 5，調整R2=0.981 2，表明回歸方程與數據的擬合度較高，模型有一定代表性，可以解釋98.12%試驗所得結果。

表 3 Box-Behnken試驗結果的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

由表3可知，模型極顯著（P＜0.000 1），且無失擬因素存在（失擬項P＞0.05）。各因素之間的交互作用影響各異，且順序依次為AB（P=0.085 3）＞AC（P=0.467 0）＞BC（P=0.582 2）。

由圖6～8可知，各因素在所選范圍均存在響應極值，這與表2模型的顯著性結果一致。根據二次回歸模型的預測，當發酵溫度為31.46 ℃、接種量為3.44%、培養時間為3.98 d時，發酵液上清對α-葡萄糖苷酶的IC50為30.5 mg/mL。為了便于后續驗證實驗的可操作性，將上述優化條件調整為發酵溫度31.5 ℃、接種量3.5%、培養時間4 d。

2.3.3 驗證實驗

為了驗證模型的可靠性，按照調整后的培養條件進行發酵，測得該條件下多黏類芽孢桿菌BD3736發酵體系對α-葡萄糖苷酶的IC50為33.4 mg/mL，與預測值（30.5 mg/mL）無顯著性差異，表明該模型能夠較好地預測實驗結果，與優化前（接種量2%、發酵溫度30 ℃、培養時間2 d）相比，IC50降低29.5%，說明優化效果達到預期。

3 結 論

本研究發現多黏類芽孢桿菌BD3736具有代謝脫脂乳、合成AGIs的能力。單因素試驗結果表明，多黏類芽孢桿菌BD3736產AGIs的最佳培養條件為接種量3%、發酵溫度32 ℃、培養時間4 d、脫脂乳質量濃度8 g/100 mL。在此基礎上，利用響應面法進一步優化，得到優選培養條件為接種量3.5%、發酵溫度31.5 ℃、培養時間4 d。該條件下，多黏類芽孢桿菌BD3736發酵脫脂乳對α-葡萄糖苷酶的IC50為30.5 mg/mL，較優化之前降低29.5%，達到預期優化目標。后續將對多黏類芽孢桿菌BD3736發酵脫脂乳產生的AGIs進行分離純化，分析活性餾分的化學結構，并對AGIs在選取的特定動物模型（自發性2型糖尿病GK大鼠）中的活性進行評價。