高效液相色譜測定乳制品、谷物粉及飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌?/h1>
2019-01-23 05:52武倫瑋劉春霞劉麗君
乳業科學與技術 2019年1期
武倫瑋，岳 虹，陳 靜，劉春霞，劉麗君
（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，是一種來源于鐮刀菌屬的單端孢霉烯族化合物。3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）和15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-acetyl-deoxynivalenol，15-ADON）為DON的乙?；苌?。食用被DON污染的食物后，會產生惡心、嘔吐、腹瀉等急性中毒癥狀。經實驗研究證實，DON及其衍生物可以和其他真菌毒素產生聯合作用，加劇動物肝、腎臟細胞膜損傷和氧化損傷，導致動物過早死亡[1-2]。目前，同時檢測DON及其乙?；苌锏姆椒ù蠖嗍鞘褂靡合嗌V-串聯質譜法[3]，該方法對硬件設備和人員的要求較高，推廣起來相比液相色譜法相對較難[4-6]。本研究建立一種適合乳制品和普通飼料基質的可同時測定DON及其乙?；苌锏母咝б合嗌V（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析方法，以供檢驗參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
甲醇、乙腈（色譜純） 諾爾施（成都科隆化學品有限公司）；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀（均為分析純） 天津風船化學試劑公司；鹽酸（分析純） 北京試劑公司；DON、3-ADON、15-ADON標準品（純度≥99.0%） 美國Sigma-Aldrich公司。
飼料采集自伊利牧場；谷粒多牛乳、益消風味酸乳及薏米粉 內蒙古伊利實業集團股份有限公司。
1.2 儀器與設備
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇3 項（DON/3-ADON/15-ADON）免疫親和柱（產品編號：HCM30508，柱容量≥1 000 ng） 北京華安麥科生物技術有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀（配備紫外檢測器）美國Agilent公司；AB265-S分析天平 瑞士Mettler-Doledo公司；3k30高速離心機 德國Sigma公司；GM 200高速粉碎機（轉速10 000 r/min） 德國Retsch公司；篩網（孔徑1～2 mm） 安平縣鴻凱金屬絲網制品廠；TurboVapLV氮吹儀 瑞典Biotage公司；KQ-600DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX 2渦旋振蕩器 德國IKA公司；HY-5搖床江蘇省金壇市醫療儀器廠；移液器（量程10～100 μL和100～1 000 μL） 德國Eppendorf公司；玻璃纖維濾紙（直徑11 cm，孔徑1.5 μm） 美國Vicam公司。
1.3 方法
1.3.1 色譜條件
液相色譜柱：艾杰爾Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或相當者[7-8]；紫外檢測波長224 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量50 μL；流動相梯度洗脫程序如表1所示。
表 1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient mobile phase composition
1.3.2 溶液配制
磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：稱取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、0.20 g KH2PO4和1.16 g Na2HPO4·12H2O，加入800 mL超純水溶解并定容至1 L；體積分數80%乙腈水溶液：將800 mL乙腈和200 mL水混合；體積分數0.1%吐溫-20水溶液：取1 mL 吐溫-20，加水定容至1 L。
標準儲備溶液（100 μg/mL）：分別稱取DON、3-ADON和15-ADON各1 mg（準確至0.01 mg），分別用乙腈溶解并定容至10 mL，-20 ℃條件下密封保存。
混合標準中間液（10 μg/mL）：分別準確吸取100 μg/mL DON、3-ADON和15-ADON標準儲備溶液各1.0 mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈定容，-20 ℃條件下密封保存。
與新款外觀設計所匹配的是經過全新升級的前后燈光組件。新一代C級長軸距車型上標配LED幾何多光束大燈，大燈內有84顆可獨立點亮或熄滅的LED光源，不僅能實現智能的光束變化，還擁有最遠650米的照明距離。同時，尾燈設計也經過了修改，燈帶點亮之后呈C字形，讓新一代C級轎車在夜晚更具辨識度。
系列標準工作溶液：準確吸取適量標準儲備溶液，用流動相（乙腈∶水=12∶88，V/V）稀釋，配制成質量濃度分別為100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列標準工作液，4 ℃條件下保存。
1.3.3 樣品處理
1.3.3.1 配合飼料、濃縮料、精補料等吸水性較小的樣本
將樣品粉碎，準確稱取4 g樣品，加入20 mL PBS緩沖溶液；用搖床劇烈振蕩20 min，充分提取，5 000 r/min離心5 min，調節pH值至中性，用微纖維濾紙過濾；取5 mL濾液過免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出；待液體流出后用20 mL水淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s；洗脫后液體于50 ℃條件下經氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃條件下存放，使用時用1 mL 20%乙腈溶液復溶；過0.45 μm有機濾膜后上機[9-11]。
1.3.3.2 乳制品
準確稱取2.5 g樣品于10 mL容量瓶，使用PBS緩沖液定容，搖床振蕩20 min，充分提取，5 000 r/min離心5 min，用微纖維濾紙過濾[12-13]；取2 mL濾液過免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出，待液體流出后用10 mL 0.1%吐溫水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，再用10 mL水淋洗，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s，洗脫后液體于50 ℃條件下用氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃存放，使用時用1 mL 20%乙腈溶液復溶，過0.45 μm有機濾膜后上機。
1.3.3.3 谷物粉、米粉
準確稱取4 g樣品（固體樣品需粉碎過篩），以1∶4（m/V）的比例加入80%乙腈水溶液（即16 mL）[14-16]，混勻，超聲提取1 5 m i n；取4 m L液體，以1∶7（m/V）的比例加入PBS緩沖液（即28 mL）稀釋，混勻，使用玻璃纖維濾紙過濾；取16 mL濾液過免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出；待液體流出后，用10 mL 0.1%吐溫水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，再用10 mL水淋洗，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s；洗脫后液體于50 ℃條件下用氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃存放，使用時用1 mL 20%乙腈溶液復溶；過0.45 μm有機濾膜后上機。
試樣中DON、15-ADON或3-ADON的含量按照下式計算。
式中：X為試樣中DON、3-ADON或15-ADON的含量/（μg/kg）；ρ1為試樣中DON、3-ADON或15-ADON的質量濃度/（ng/mL）；ρ0為空白試樣中DON、3-ADON或15-ADON的質量濃度/（ng/mL）；V為樣品洗脫液的最終定容體積/mL；f為樣液稀釋因子；m為試樣質量/g。
2 結果與分析
2.1 樣品前處理條件的選擇
DON易溶于極性溶劑，如水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，吸水性較小的樣本可以直接用水提取，既有較高的提取效率、又經濟無毒。而選擇PBS緩沖鹽體系，則是為了保證溶液體系呈中性，以保證免疫親和柱不失活。對于吸水性較大的樣品則需要添加沉淀劑，加入80%乙腈水溶液，然后將乙腈提取液稀釋到一定比例，是為了防止乙腈破壞免疫親和柱，使免疫親和柱失活。DON及其乙?；苌餃y定的基礎是抗原和抗體反應，抗體連接在柱體內，樣品經過提取、過濾后緩慢通過免疫親和柱，在免疫親和柱內毒素與抗體結合，之后洗滌免疫親和柱，除去沒有被結合的其他無關物質[14-16]。用甲醇洗脫，然后注入液相色譜儀進行檢測。
2.2 色譜柱和流動相的選擇
采用艾杰爾Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，對于其他C18色譜柱，經過實驗驗證，色譜峰有可能會出現15-ADON、3-ADON被雜質峰覆蓋等情況。流動相選擇乙腈和水，在目標峰周圍無雜峰干擾，定量準確。如果使用甲醇和水進行洗脫，效果不太理想，或在上述條件下無法分離目標化合物。
2.3 標準曲線及檢出限
將不同質量濃度的DON、15-ADON或3-ADON工作液在上述洗脫條件下經液相色譜儀測定。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。
表 2 DON、3-ADON及15-ADON的標準曲線及定量限Table 2 Standard curves and limits of quantitation for DON, 3-ADON and 15-ADON
由表2可知，標準曲線的線性關系良好，按照信噪比（RS/N）=10，計算得出該方法的定量限為100 μg/kg。
將DON、15-ADON及3-ADON的混合標準樣品按照上述色譜條件進樣，所得色譜圖如圖1所示。飼料樣品中加入DON、15-ADON及3-ADON的混合標準品后所得色譜圖如圖2所示。
2.4 方法回收率和精密度
分別向飼料、谷物乳、發酵乳和谷物粉中添加不同質量濃度的DON、15-ADON和3-ADON，進行加標回收率實驗，分別平行測定6 次。
表 3 不同樣品的加標回收率測定結果（n= 6）Table 3 Recoveries of spiked samples (n= 6)
由表3可知，本底樣品中DON、15-ADON和3-ADON的添加量為100～500 μg/kg時，飼料、谷物乳、發酵乳和谷物粉中的回收率分別為84.4%～99.9%、94.3%～101.6%、96.0%～103.7%和88.8%～100.0%。
表 4 不同樣品的精密度測定結果Table 4 Precision (RSD) for replication determinations of different samples
對飼料、谷物乳、發酵乳和谷物粉檢出限附近的加標樣品分別進行6 次重復測定。由表4可知，本方法的準確度滿足定量要求，方法精密度良好。
3 結 論
本研究采用HPLC法對乳品和飼料中的DON及其乙?；苌镞M行含量測定，本方法適用于飼料、液態乳、酸乳、米粉及谷物粉中DON及其乙?；苌锏暮繖z測。樣品中加入PBS緩沖溶液作為提取劑，采用免疫親和柱凈化，氮吹儀濃縮后用流動相復溶，C18色譜柱分離，流動相為乙腈和水，進行梯度洗脫，目標峰不受雜質峰干擾，測定結果準確。
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脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，是一種來源于鐮刀菌屬的單端孢霉烯族化合物。3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）和15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-acetyl-deoxynivalenol，15-ADON）為DON的乙?；苌?。食用被DON污染的食物后，會產生惡心、嘔吐、腹瀉等急性中毒癥狀。經實驗研究證實，DON及其衍生物可以和其他真菌毒素產生聯合作用，加劇動物肝、腎臟細胞膜損傷和氧化損傷，導致動物過早死亡[1-2]。目前，同時檢測DON及其乙?；苌锏姆椒ù蠖嗍鞘褂靡合嗌V-串聯質譜法[3]，該方法對硬件設備和人員的要求較高，推廣起來相比液相色譜法相對較難[4-6]。本研究建立一種適合乳制品和普通飼料基質的可同時測定DON及其乙?；苌锏母咝б合嗌V（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析方法，以供檢驗參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
甲醇、乙腈（色譜純） 諾爾施（成都科隆化學品有限公司）；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀（均為分析純） 天津風船化學試劑公司；鹽酸（分析純） 北京試劑公司；DON、3-ADON、15-ADON標準品（純度≥99.0%） 美國Sigma-Aldrich公司。
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1.3 方法
1.3.1 色譜條件
液相色譜柱：艾杰爾Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或相當者[7-8]；紫外檢測波長224 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量50 μL；流動相梯度洗脫程序如表1所示。
表 1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient mobile phase composition
1.3.2 溶液配制
磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：稱取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、0.20 g KH2PO4和1.16 g Na2HPO4·12H2O，加入800 mL超純水溶解并定容至1 L；體積分數80%乙腈水溶液：將800 mL乙腈和200 mL水混合；體積分數0.1%吐溫-20水溶液：取1 mL 吐溫-20，加水定容至1 L。
標準儲備溶液（100 μg/mL）：分別稱取DON、3-ADON和15-ADON各1 mg（準確至0.01 mg），分別用乙腈溶解并定容至10 mL，-20 ℃條件下密封保存。
混合標準中間液（10 μg/mL）：分別準確吸取100 μg/mL DON、3-ADON和15-ADON標準儲備溶液各1.0 mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈定容，-20 ℃條件下密封保存。
與新款外觀設計所匹配的是經過全新升級的前后燈光組件。新一代C級長軸距車型上標配LED幾何多光束大燈，大燈內有84顆可獨立點亮或熄滅的LED光源，不僅能實現智能的光束變化，還擁有最遠650米的照明距離。同時，尾燈設計也經過了修改，燈帶點亮之后呈C字形，讓新一代C級轎車在夜晚更具辨識度。
系列標準工作溶液：準確吸取適量標準儲備溶液，用流動相（乙腈∶水=12∶88，V/V）稀釋，配制成質量濃度分別為100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列標準工作液，4 ℃條件下保存。
1.3.3 樣品處理
1.3.3.1 配合飼料、濃縮料、精補料等吸水性較小的樣本
將樣品粉碎，準確稱取4 g樣品，加入20 mL PBS緩沖溶液；用搖床劇烈振蕩20 min，充分提取，5 000 r/min離心5 min，調節pH值至中性，用微纖維濾紙過濾；取5 mL濾液過免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出；待液體流出后用20 mL水淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s；洗脫后液體于50 ℃條件下經氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃條件下存放，使用時用1 mL 20%乙腈溶液復溶；過0.45 μm有機濾膜后上機[9-11]。
1.3.3.2 乳制品
準確稱取2.5 g樣品于10 mL容量瓶，使用PBS緩沖液定容，搖床振蕩20 min，充分提取，5 000 r/min離心5 min，用微纖維濾紙過濾[12-13]；取2 mL濾液過免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出，待液體流出后用10 mL 0.1%吐溫水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，再用10 mL水淋洗，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s，洗脫后液體于50 ℃條件下用氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃存放，使用時用1 mL 20%乙腈溶液復溶，過0.45 μm有機濾膜后上機。
1.3.3.3 谷物粉、米粉
準確稱取4 g樣品（固體樣品需粉碎過篩），以1∶4（m/V）的比例加入80%乙腈水溶液（即16 mL）[14-16]，混勻，超聲提取1 5 m i n；取4 m L液體，以1∶7（m/V）的比例加入PBS緩沖液（即28 mL）稀釋，混勻，使用玻璃纖維濾紙過濾；取16 mL濾液過免疫親和柱凈化，濾液以1～2 滴/s的速率流出；待液體流出后，用10 mL 0.1%吐溫水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3 滴/s，再用10 mL水淋洗，并充分排干；取2 mL甲醇洗脫，用玻璃試管接洗脫液，流速1 滴/s；洗脫后液體于50 ℃條件下用氮吹儀吹干，殘余物于4 ℃存放，使用時用1 mL 20%乙腈溶液復溶；過0.45 μm有機濾膜后上機。
試樣中DON、15-ADON或3-ADON的含量按照下式計算。
式中：X為試樣中DON、3-ADON或15-ADON的含量/（μg/kg）；ρ1為試樣中DON、3-ADON或15-ADON的質量濃度/（ng/mL）；ρ0為空白試樣中DON、3-ADON或15-ADON的質量濃度/（ng/mL）；V為樣品洗脫液的最終定容體積/mL；f為樣液稀釋因子；m為試樣質量/g。
2 結果與分析
2.1 樣品前處理條件的選擇
DON易溶于極性溶劑，如水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，吸水性較小的樣本可以直接用水提取，既有較高的提取效率、又經濟無毒。而選擇PBS緩沖鹽體系，則是為了保證溶液體系呈中性，以保證免疫親和柱不失活。對于吸水性較大的樣品則需要添加沉淀劑，加入80%乙腈水溶液，然后將乙腈提取液稀釋到一定比例，是為了防止乙腈破壞免疫親和柱，使免疫親和柱失活。DON及其乙?；苌餃y定的基礎是抗原和抗體反應，抗體連接在柱體內，樣品經過提取、過濾后緩慢通過免疫親和柱，在免疫親和柱內毒素與抗體結合，之后洗滌免疫親和柱，除去沒有被結合的其他無關物質[14-16]。用甲醇洗脫，然后注入液相色譜儀進行檢測。
2.2 色譜柱和流動相的選擇
采用艾杰爾Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，對于其他C18色譜柱，經過實驗驗證，色譜峰有可能會出現15-ADON、3-ADON被雜質峰覆蓋等情況。流動相選擇乙腈和水，在目標峰周圍無雜峰干擾，定量準確。如果使用甲醇和水進行洗脫，效果不太理想，或在上述條件下無法分離目標化合物。
2.3 標準曲線及檢出限
將不同質量濃度的DON、15-ADON或3-ADON工作液在上述洗脫條件下經液相色譜儀測定。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。
表 2 DON、3-ADON及15-ADON的標準曲線及定量限Table 2 Standard curves and limits of quantitation for DON, 3-ADON and 15-ADON
由表2可知，標準曲線的線性關系良好，按照信噪比（RS/N）=10，計算得出該方法的定量限為100 μg/kg。
將DON、15-ADON及3-ADON的混合標準樣品按照上述色譜條件進樣，所得色譜圖如圖1所示。飼料樣品中加入DON、15-ADON及3-ADON的混合標準品后所得色譜圖如圖2所示。
2.4 方法回收率和精密度
分別向飼料、谷物乳、發酵乳和谷物粉中添加不同質量濃度的DON、15-ADON和3-ADON，進行加標回收率實驗，分別平行測定6 次。
表 3 不同樣品的加標回收率測定結果（n= 6）Table 3 Recoveries of spiked samples (n= 6)
由表3可知，本底樣品中DON、15-ADON和3-ADON的添加量為100～500 μg/kg時，飼料、谷物乳、發酵乳和谷物粉中的回收率分別為84.4%～99.9%、94.3%～101.6%、96.0%～103.7%和88.8%～100.0%。
表 4 不同樣品的精密度測定結果Table 4 Precision (RSD) for replication determinations of different samples
對飼料、谷物乳、發酵乳和谷物粉檢出限附近的加標樣品分別進行6 次重復測定。由表4可知，本方法的準確度滿足定量要求，方法精密度良好。
3 結 論
本研究采用HPLC法對乳品和飼料中的DON及其乙?；苌镞M行含量測定，本方法適用于飼料、液態乳、酸乳、米粉及谷物粉中DON及其乙?；苌锏暮繖z測。樣品中加入PBS緩沖溶液作為提取劑，采用免疫親和柱凈化，氮吹儀濃縮后用流動相復溶，C18色譜柱分離，流動相為乙腈和水，進行梯度洗脫，目標峰不受雜質峰干擾，測定結果準確。
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