BRAF V600E基因檢測聯合細針穿刺活檢對甲狀腺結節良惡性診斷中的價值

盧振啟 龔文博 黑虎 秦建武

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤。近年隨著高分辨率彩超的普及與人們在體檢中對甲狀腺檢查的重視，在全球范圍內甲狀腺癌的檢出率呈明顯上升［1］。2018年全球癌癥統計數據顯示，甲狀腺癌已成為全球癌癥發病率第9 大腫瘤［2］。及時發現和診斷對緩解患者心理壓力和提供有效的治療十分重要。細針穿刺活檢（fine needle aspiration biopsy，FNA）是目前評估甲狀腺結節良惡性敏感度和特異度最高的方法［3-4］，但仍有10%～30%的結節無法明確診斷［5］。因此從基因水平尋找高相關性的腫瘤標志物尤為重要。有研究表明BRAF 基因作為甲狀腺癌最常見的遺傳學突變［6］，在甲狀腺乳頭狀癌（papil?lary thyroid carcinoma，PTC）的發生發展中占據重要地位。FNA 聯合BRAF V600E 基因突變檢測進一步提高診斷的敏感度和準確度，對甲狀腺癌的診斷、分層、治療及預后的評估具有重要的指導意義［7］。本研究探討BRAF V600E 基因檢測聯合超聲引導下FNA對甲狀腺良惡性結節的臨床診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月至2018年6月鄭州大學附屬腫瘤醫院首次收治、診斷為甲狀腺腫物入院行FNA 及穿刺洗脫液BRAF 基因檢測并接受手術的患者為研究對象。經過嚴格查閱與篩選的121 例共130 枚可疑結節納入本研究。納入標準：1）術前有完整高分辨率彩超記錄且評估結節為可疑惡性（TI-RAS 分類4 類及以上結節）；2）術前行FNA 及穿刺洗脫液BRAF 基因檢測；3）初次行甲狀腺手術治療；4）術后病理明確；5）具有完整病歷資料及病理報告。所有患者穿刺及術前均簽署知情同意書。排除標準：1）多次手術患者；2）非本院行FNA及穿刺洗脫液BRAF基因檢測；3）病歷資料不完整。

1.2 方法

1.2.1 穿刺方法 核對患者信息后患者取仰臥位，頸部墊高過伸位，頸部常規消毒，鋪無菌洞巾，超聲探頭無菌處理，超聲定位結節，設計穿刺路徑，穿刺點進針。超聲引導下用23G穿刺針進入甲狀腺結節，在結節內重復提插穿刺針數次完成取材，每枚結節穿刺2 針，個別結節穿刺3 針。標本立即涂片固定，觀察標本是否滿足細胞學診斷要求。穿刺針用1 mL生理鹽水沖洗，洗脫液用PE管儲存，送本院分子病理科行RT-RCR檢測［8］。根據需要重復穿刺步驟，通常每個結節穿刺2 次。穿刺完畢，貼敷料，在觀察區留置觀察20 min，穿刺點壓迫止血20 min，向患者交代注意事項。

FNA 結果根據Bethesda 診斷系統分為：Ⅰ類，標本無法診斷；Ⅱ類，良性病變；Ⅲ類，意義不明確的非典型病變；Ⅳ類，濾泡性腫瘤；Ⅴ類，可疑惡性腫瘤；Ⅵ類，惡性腫瘤。

1.2.2 BRAF V600E檢測 取FNA洗脫液標本，采用標準酚-氯仿抽提法提取DNA溶液。PCR擴增BRAF第15號外顯子，引物序列設計為正向引物，5'-ACTCTTCA TAATGCTTGCTC-3'，反向引物，5'-TAGTTGAGACCTTC AATGAC-3'，擴增片段長度275 bp。所有擴增片段經電泳證實后，進行測序。BRAF V600E基因檢測結果分為野生型和突變型。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，以術后病理學結果為“金標準”，計數資料的比較采用χ2檢驗。，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

130 枚穿刺標本結果中，術后病理學檢查PTC 120枚，良性10枚。標本不能診斷或不滿意3枚（1枚術后診斷為良性，2枚診斷為PTC）、良性病變9枚（術后診斷為良性8枚，惡性1枚）、意義不明確的非典型病變1枚（術后診斷為良性）、可疑惡性腫瘤19枚（術后診斷均為惡性）、惡性腫瘤98 枚（術后診斷均為PTC），見表1。

BRAF V600E基因突變檢查結果：野生型27枚（術后診斷良性10枚，PTC 17枚），突變型103枚（術后診斷均為PTC）。術后病理證實：惡性120 枚，良性10 枚。BRAF V600E突變率79.2%（103/130），見表2。

表1 甲狀腺結節細針穿刺細胞學結果和術后病理學結果 枚

表2 BRAF基因檢測結果和術后病理學結果 枚

細胞學診斷的敏感度和準確度分別為81.7%和83.1%。洗脫液BRAF V600E基因檢測的敏感度和準確度分別為85.8%和86.9%。BRAF 基因檢測聯合FNA 將細胞學穿刺的敏感度由81.7%升至92.5%（P＜0.05），準確度由83.1%升至92.3%（P＜0.05），差異具有統計學意義（表3）。

不同直徑結節細胞學診斷結果：結節直徑≤5 mm的細胞學診斷中，無法診斷及可疑惡性比例（10/21枚）遠大于結節直徑6～10 mm（7/63 枚）和直徑>10 mm（5/46枚）結節（表4）。結節直徑≤5 mm細胞學診斷的敏感度和準確度（47.6%和52.4%）遠低于直徑6～10 mm（85.7%和88.9%）及直徑>10 mm（73.9%和87.0%），差異具有統計學意義（P＜0.01），見表5。

表3 FNA、BRAF及FNA聯合BRAF基因檢測結果 枚

表4 不同直徑甲狀腺結節FNA結果 枚

洗脫液BRAF V600E 基因突變檢測采用穿刺針中殘留的組織作為標本，不同直徑的結節BRAF V600E基因突變檢測無顯著性差異（P>0.05，表6）。

表5 FNA檢測結果

表6 不同直徑甲狀腺結節BRAF V600E檢測結果

3 討論

FNA 作為目前評估甲狀腺結節最可靠、最有價值的診斷手段之一，也是安全、方便、經濟、有效鑒別甲狀腺結節良惡性的微創方法，常與高分辨率彩超結合進行甲狀腺結節良惡性診斷，但仍有10%～30%的結節無法明確診斷［5］。本研究中3.1%（4/130例）患者無法明確性質，其中僅50.0%（2/4 例）需要手術。粗針穿刺活檢包括超聲引導下的粗針活檢和CT引導下經皮甲狀腺結節粗針活檢，可以最大限度地明確診斷、減少假陰性。但粗針穿刺活檢對結節直徑要求較高，要求結節直徑在2 cm 以上，而且出血等并發癥較多。而目前臨床上微小PTC發病率逐年升高，粗針穿刺活檢已不符合臨床主要需求。

有研究認為穿刺準確度與可疑結節直徑相關，穿刺直徑越小，超聲引導下定位取材越困難，但甲狀腺癌灶直徑是否是FNA無法確切診斷的獨立因素，研究結果不一。孫永清等［9］研究認為結節大小及位置均可影響FNA的準確度。Moon等［10］認為以直徑6 mm為界，直徑＜6 mm穿刺的不滿意發生率約20.8%。Mazzaferri等［11］認為對于直徑≤5 mm結節，穿刺取材不滿意度較高，不建議對直徑≤5 mm結節進行穿刺。但是Zhong等［12］研究認為，FNA對不同結節大小穿刺的敏感度、特異度及準確度差異均無統計學意義。本研究發現，當穿刺結節直徑≤5 mm時，單純細胞學診斷的不確定結節數量為47.6%（10/21枚），成為影響細胞學診斷質量的一個重要因素。此外，直徑≤5 mm可疑結節細胞學診斷的敏感度及準確度均遠低于直徑>5 mm組，差異具有統計學意義。因此本研究認為，穿刺結節直徑在一定程度上影響細胞學的診斷結果。洗脫液BRAF V600E基因突變檢測采用穿刺針中殘留的組織作為標本，不同直徑的結節BRAF V600E基因突變檢測差異無統計學意義，BRAF V600E基因突變檢測一定程度上降低了可疑結節直徑對于穿刺準確度的影響。因此，本研究認為對于直徑較小的可疑結節，有必要輔以基因檢測提高診斷準確度。

BRAF V600E基因突變作為PTC中最常見的遺傳學突變［13-14］，通過突變導致BRAF蛋白激活，直接引起下游MEK蛋白磷酸化，最終導致MAPK信號途徑持續激活，從而引起細胞過度增殖、分化及腫瘤的發生，已經被作為PTC診斷及預后的一個重要指標應用于臨床。BRAF V600E基因突變對PTC具有高度特異度，鮮見在濾泡癌、腺瘤或良性腫瘤中發現的報道［15-16］，其特點使其成為FNA輔助病理分子診斷的一個重要工具，被作為PTC診斷及預后的一個重要指標應用于臨床。本研究中，BRAF V600E基因突變103例，術后病理證實均為甲狀腺乳頭狀癌，特異度達100%，體現了BRAF V600E基因的高度特異度。但未檢測到BRAF V600E基因突變時，不能排除甲狀腺乳頭狀癌的診斷。本研究中，BRAF V600E基因突變野生型27例，術后病理證實PTC 17例，良性10例，因此對于基因突變野生型結果的判讀應當慎重。對于穿刺無法明確性質且BRAF V600E基因為野生型的患者，本研究建議患者定期隨訪或者3個月后重復穿刺。

Zhao 等［17］和Brown 等［18］研究均認為，BRAF 基因檢測聯合FNA 細胞學檢查大幅提高了穿刺的敏感度。Zatelli等［19］研究認為BRAF V600E基因突變分析提高了細胞學診斷的敏感度（由77%升至87%）。本研究中，穿刺洗脫液BRAF基因輔助檢測將FNA的敏感度由81.7%提升至92.5%，診斷的準確度由83.1%提升至92.3%，印證了BRAF 基因檢測聯合FNA 細胞學檢測能提高穿刺穿敏感度和準確度的觀點。本研究敏感度的顯著提高主要來源于細胞學診斷中診斷不明確的結節（意義不明確的非典型病變及標本無法診斷），BRAF V600E 基因突變檢測幫助制定明確的手術計劃，避免不必要的手術范圍，同時幫助減少其他不必要的檢驗，如重復穿刺。因此，對于診斷不明確的結節行BRAF V600E 基因檢測對于患者的診斷和治療十分有意義。

FNA聯合洗脫液BRAF V600E基因突變檢測，彌補了細胞學診斷受細胞量、細胞形態、閱片經驗等因素的影響，借助洗脫液BRAF V600E 基因突變檢測，通過測定BRAF V600E 基因在可疑結節中的表達情況，有助于提高甲狀腺結節良惡性鑒別的準確度，指導甲狀腺癌的風險分層及預后評估，提供治療的決策信息（是否手術及手術范圍的大?。?0］，且洗脫液BRAF基因檢測不需要額外的穿刺標本，通過FNA標本即可檢驗，同時又可降低標本采集及制片等影響因素的干擾［21］。

綜上所述，洗脫液BRAF V600E基因突變檢測作為FNA 的有效診斷手段補充，提高了穿刺的敏感度和準確度。尤其對于穿刺結果中意義不明確的結節，可以輔助聯合BRAF V600E 基因突變檢測，以提高診斷的準確度。