水稻窄葉突變體zy103突變基因鑒定

楊永義 周學標 姚方印 侯恒軍 孫召文 袁守江張洪瑞 李廣賢,?

(1山東省水稻研究所,山東 濟南 250100；2山東省農作物種質資源中心,山東 濟南 250100；3 山東省農業科學院高新技術研究中心,山東 濟南 250100；4濟寧市任城區農業局, 山東 濟寧 272000)

水稻(Oryza sativa L.)葉片是進行光合作用的主要營養器官,葉片厚、直、略細、微卷是水稻理想株型育種的基本要求[1]。水稻葉片適當變窄,可以增加單株及群體的通透性,提高光合效率,最終有利于提高產量或改良品質[2]。闡明水稻窄葉形成的分子機理,可以從遺傳上控制水稻株型,為理想株型育種奠定基礎。

目前,通過人工誘變技術已獲得了多個水稻窄葉突變體,這些突變體主要表現為葉脈減少,葉片變細,但同時也常伴隨其他復合性狀變化,如葉片變短、葉片卷曲、植株矮化等[3-4]。水稻窄葉多為單基因控制質量性狀,迄今已報道了多個窄葉突變基因(nal1 ～nal10、nrl1 和nrl2),這些基因主要分布于水稻第1、第3、第4、第11、第12 號染色體上,其中nal1、nal2/nal3、nal7、nal9、nrl1 和nrl2 已被成功克隆[5]。nal1 基因位于水稻第4 號染色體,與qFLW4、LSCHL4 和nrl5 基因等位[3,6-7],編碼與生長素極性運輸相關的植物特異蛋白,通過細胞分裂調控葉片的橫向生長和株高變化[8-9]。nal2 與nal3 是旁系同源關系,二者分別位于水稻第11、第12 號染色體,編碼相同的OsWOX3A 轉錄激活因子[10]。研究表明,OsWOX3A 影響水稻多個器官的發育,如葉片的橫軸生長和維管束形成,小穗的內外稃形態建成以及分蘗和側根發育等[4,10]。nal7 位于水稻第3 號染色體,與OsCOW1 基因等位,編碼一個YUCCA 家族蛋白的含黃素單氧化酶,通過調節植株生長素的生物合成調控葉片發育[11-12]。nrl9 也位于水稻第3 號染色體,與VYL 和ClpP 同源,VYL 是擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉綠體Clp 蛋白酶亞基ClpP6 在水稻中的同源蛋白,能與Clp 蛋白酶亞基OsClpP3 和OsClpP4 互作,在水稻葉綠體生物合成中發揮重要作用[13-14]。nrl1 和nrl2 是水稻中2 個非等位的窄卷葉突變基因[15-16],二者位于水稻不同的染色體上。nrl1位于第12 號染色體,與nd1、sle1、ndl1 和cd1 基因等位,編碼一個類纖維素合酶蛋白OsCSLD4；OsCSLD4在細胞壁的形成、葉的形態發生、營養及生殖器官的發育過程中均發揮著重要作用[17-19]。nrl2 位于第3 號染色體,與srl2 和avb 基因等位,編碼一個未知生化功能的植物特異蛋白,參與水稻次生細胞壁形成和苯丙氨酸代謝[16,20-21]。由此可見,水稻葉型變異原因復雜多樣,位點不同的基因突變引發水稻葉型變異的分子機制存在較大差異,同一基因的不同等位突變對水稻葉型變異的影響也不完全一致。因此,有必要創造或發現更多的水稻葉型突變體,為系統解析水稻葉型變異的分子機理奠定基礎。

9311/豫粳6 號秈粳雜交的F7株系中獲得的水稻窄葉突變體zy103,與野生型親本(豫粳6 號和9311)相比,突變體從苗期至成熟期表現出葉片變窄微卷、株高降低、結實率下降、多數成熟籽粒彎曲變形等。本研究應用zy103/9311 的F2、F3 分離群體對窄葉基因進行精細定位及候選基因預測,以期為解析水稻窄葉形成的分子機理和水稻理想株型育種奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從秈稻品種9311 與粳稻品種豫粳6 號(YJ6)雜交F7株系中獲得窄葉突變體zy103,連續自交后,發現其窄葉性狀能穩定遺傳。將zy103 與其野生型親本9311 多代回交和自交,從BC5F3中獲得具有窄葉突變表型的9311 近等基因系zy1039311。以野生親本9311、豫粳6 號(YJ6)、突變體zy103 及近等基因系zy1039311為材料進行表型鑒定。通過突變體zy103 與9311 之間的雜交-自交,構建水稻窄葉性狀的分離群體,進行性狀遺傳和基因定位分析。

1.2 農藝性狀調查

在山東濟寧種植野生親本9311、豫粳6 號、突變體zy103 及近等基因系zy1039311,觀察水稻苗期野生親本和突變體的根系發育,分蘗期調查其葉形,成熟期測量其葉寬、株高、穗長、各節間長度、穗粒數、結實率、粒長和粒寬等主要農藝性狀,每個樣本調查20 株。利用DPS 軟件進行方差分析,多重比較采用Duncan 新復極差測驗(P＜0.01)。

1.3 葉片橫切面觀察

水稻抽穗期時,從田間分別取野生型9311 和突變體zy103 的倒三葉,每個葉片材料取20 個。切片制作參考龍海馨[22]的方法。將剛取下的新鮮葉片完全浸沒在FAA 固定液(95 mL 70%乙醇+5 mL 37%乙醛+ 5 mL 冰醋酸)中,固定28 h 后于4℃保存備用。選取葉片最寬部位截取1 cm 左右,每個材料各取10 個葉片,置于石蠟中,徒手切片后,選取合適的樣品,置于載玻片上,在顯微鏡下觀察葉片橫切面,并統計葉片大、小葉脈數目。

1.4 突變性狀的遺傳分析及目的基因定位

1.4.1 突變性狀的遺傳 構建zy103/9311 的F2分離群體,在水稻分蘗及成熟期調查400 株F2個體,并根據正常葉型與窄葉突變體植株的分離比例進行突變性狀的遺傳分析。

1.4.2 目的基因的初定位 采用BSA(bulked segregate analysis)法[23]從zy103/9311 F2分離群體中分別選擇窄葉突變表型單株和正常葉形單株各20 株,提取各單株的DNA 并等量混合,構建突變型和野生型DNA 池。從McCouch 等[24]和Matsumoto 等[25]發表的遺傳圖譜上選取SSR 標記,對分離群體的親本(zy103和9311)及2 個DNA 池進行多態性檢測,找出與目標基因連鎖的標記。應用目標基因的連鎖標記,檢測zy103/9311 的F2分離群體中的突變性狀植株(94 株)的基因型,依據Zhang 等[26]的方法計算標記與目的基因的重組率,確定目標基因所在的染色體區間。

1.4.3 目的基因的精細定位 根據基因初定位結果,從zy103/9311 的F2群體中選擇目標基因染色體區段為雜合的單株,自交后獲得F3的分離群體(8 500株),從中選擇突變性狀單株,應用連鎖標記檢測其基因型。同時在目標基因初定位的染色體區間,利用軟件Primer Premier 5.0 設計STS 和Indel 標記,利用其多態性標記對目標基因初定位的染色體區間進行加密,縮短目標基因所在的染色體區間。

1.5 候選基因預測

基因注釋應用網站(http：/ /rice.plantbiology.msu.edu/)。候選基因序列測定及分析參照李廣賢等[27]的方法。

2 結果與分析

2.1 突變體的表型特征

突變體zy103 及近等基因系zy1039311與野生型親本YJ6、9311 相比,主要突變性狀表現為從苗期開始葉片變窄且向內微卷,成熟期時突變體的旗葉、倒二葉、倒三葉的葉寬均顯著低于野生型(表1)。此外,突變體苗期根系發育不良,根長變短且根的數目減少(圖1-A),分蘗期,突變體寬度明顯變窄(圖1-B)；成熟期株高顯著降低(圖1-C),主要是由于穗長、穗下莖、第Ⅰ、第Ⅱ、第Ⅲ、第Ⅳ、第Ⅴ莖節長度均不同程度縮短造成的(表1)；同時還表現出穗粒數減少,結實率降低,且籽粒大小和形狀均發生明顯變化,主要表現在籽粒變細、長度增加,且多數成熟籽粒彎曲變形等(圖1-D,表1)。

圖1 野生型親本(YJ6 和9311)與突變體(zy103 和zy1039311)的表型Fig.1 Phenotypes of wild-type parents (YJ6 and 9311) and mutant(zy103 and zy1039311)

表1 野生型親本(YJ6 和9311)與突變體(zy103 和zy1039311)的農藝性狀Table 1 Agronomic characters of wild-type parents (YJ6 and 9311) and mutant(zy103 and zy1039311)

2.2 葉片細胞學觀察

葉片細胞學觀察發現,野生型親本9311 與突變體zy103 的大、小葉脈數目差異明顯,與9311 相比,突變體zy103 的大、小葉脈數均極顯著降低,其中大葉脈數量減少30.1%,小葉脈數量減少48.5%,說明突變體zy103 葉片寬度的變化主要是由于大、小葉脈數量減少造成的(圖2)。

顯微鏡觀察發現,與野生型親本9311 相比,突變體zy103 大葉脈變小,小葉脈變化不明顯,但小葉脈維管束鞘薄壁細胞明顯變大,推測突變體zy103 葉脈在發育過程中可能存在異常。此外,突變體葉片近軸端大葉脈處葉表面厚壁細胞層數減少,但近軸端泡狀細胞數量增多且變大,尤其是突變體zy103 葉片近邊緣區出現大量泡狀細胞堆積(圖3),推測這些泡狀細胞可能與突變體zy103 的葉片微卷有關。

圖2 野生型親本9311 與突變體zy103 大、小葉脈數比較Fig.2 Comparison the number of large and small leaf veins wild-type parent 9311 and mutant zy103

2.3 突變性狀的遺傳分析

表型分析發現,突變體zy103 與9311 雜交獲得的F1植株葉寬正常且與9311 相似,自交后F2群體中植株葉寬發生了寬窄性狀分離。隨機調查F2群體中400 個單株,正常葉寬植株和窄葉突變植株分別為306和94 株,卡方分析表明(χ2=0.48=3.84, P=0.49＞0.05),正常葉寬植株和窄葉突變植株的數目呈3 ∶1比例,符合孟德爾遺傳規律,推測此窄葉突變性狀受1 對隱性核基因控制。

2.4 突變基因的分子標記定位及候選基因分析

圖3 野生型9311 與突變體zy103 的葉片解剖特征Fig.3 Anatomical features of the wild-type 9311 and mutant zy103 leaves

2.4.1 突變基因的分子標記定位 從zy103/9311 雜交F2群體中分別選取窄卷葉突變型和正常表型單株各20株,混合構建突變型和野生型DNA池。從水稻12 條染色體上選取350 個SSR 標記,對突變體zy103、9311、F2突變型和野生型DNA 池進行BSA 分析,結果發現位于第12 號染色體上SSR 標記RM519 和RM28448 在親本和兩池間均表現出明顯的多態性,且突變型池的帶型與突變體zy103 的帶型一致。應用RM519 和RM28448 分析zy103/9311 的F2群體中的94 個突變型單株的基因型,結果顯示,標記RM519 中93 個單株的帶型與突變體zy103 一致,僅有1 個單株發生了交換,而RM28448 的所有突變表型單株帶型均與突變體zy103 一致,說明zy103 突變基因與SSR 標記RM519 和RM28448 緊密連鎖。

次年,從zy103/9311 的F2群體中選擇標記RM519 和RM28448 的染色體區間呈雜合的正常表型單株,自交獲得F3群體。共種植F3群體8 500 株,其中正常表型單株6 412 株,窄卷葉突變表型單株2 088株,也呈孟德爾的3 ∶1理論分離比例(χ2=0.863.84, P=0.35＞0.05),進一步證實此窄卷葉突變性狀由一對隱性單基因控制。在連鎖標記RM519 和RM28448 的染色體區域附近設計了32 對STS 標記和24 對Indel 標記,其中7 對(標記引物詳見表2)在親本和基因池間存在多態性。應用上述多態性標記對2 088株窄卷葉突變表型單株進行標記基因型檢測和連鎖分析,最終將突變基因zy103 定位于STS 標記zy-7 和zy-21 之間約195.4 kb 的染色體區段內(圖4-A)；zy103 的候選基因OsCSLD4 包括2 個外顯子和1個內含子,外顯子上8 個膜結構域(第1 個跨膜結構域被內含子隔開),中心結構域D_D_D_QxxRW 位于第2外顯子上,編碼1 個由1 215 個氨基酸組成的類纖維素合酶OsCSLD4(圖4-B)；變體中OsCSLD4 基因的編碼區第2 外顯子第3 472 ～第3 479 處有8 個核苷酸(TGTGCCAC)缺失,造成移碼突變(圖4-C)； 對水稻OsCSLD 蛋白第7 和第8 跨膜結構域的氨基酸序列進行比對發現,突變體中原編碼蛋白第Ⅶ和第Ⅷ跨膜區保守功能結構域丟失(圖4-D)。

表2 zy103 基因定位標記及候選基因LOC_Os12g36890.1 測序引物Table 2 zy103 gene mapping markers and its candidate gene LOC_Os12g36890.1 sequence primers

2.4.2 候選基因預測 利用水稻基因組注釋網站(http：/ /rice.plantbiology.msu.edu)對突變基因zy103所在195.4 kb 區間序列進行候選基因分析,共預測了此染色體區間內28 個編碼基因(表3)。OsCSLD4 在植株生長過程中對葉的形態發生和營養發育起重要作用[17,28]。根據LOC_Os12g36890.1 的基因組序列設計測序引物(表2),對野生型親本豫粳6 號、9311 及突變體zy103 中的LOC_Os12g36890.1 的基因組序列進行擴增并測序。測序結果表明,在突變體中LOC_Os12g36890.1 基因的編碼區第2 外顯子處(3 472～3 479)有8 個核苷酸(TGTGCCAC)缺失。針對此缺失區域設計了一對缺失多態引物zy-OsCSLD(正向：5′-GAGTTCCCGCAGTGGAGCAA-3′；反向：5′-GATCATGG AGATGAGGCCCG-3′),利用這對引物對zy103/9311 F2群體的400 個單株進行基因型分析,結果表明,所有窄葉突變表型單株的帶型一致,均為142 bp,而正常表型單株帶型有2 種,即9311 帶型150 bp 和雜合2 種帶型150/142 bp(圖5)。蛋白同源比較分析發現水稻中存在5 個CSLD 蛋白家族成員(OsCSLD1 ～OsCSLD5),這些蛋白均包含8 個保守的跨膜結構域和一個D_D_QxxRW 蛋白模體結構,而突變體zy103 因OsCSLD4 基因中8 個核苷酸缺失導致編碼蛋白在第1 158 氨基酸處發生了移碼突變,該突變導致編碼蛋白第Ⅶ、第Ⅷ跨膜結構域缺失,推測此突變因影響了OsCSLD4 蛋白功能從而引發了突變體zy103 表型變異。因此,LOC_Os12g36890.1 可能是zy103 的候選基因。

3 討論

目前已在擬南芥、玉米和水稻中發現了多個CSLD基因,其中AtCSLD2[29-30]、AtCSLD3[31]、OsCSLD1[32]和ZmCSLD5[33]可能參與植物根系發育,OsCSLD4[17,28]、AtCSLD5[34]和ZmCSLD1[35]參與植物株高和葉形的形態建成,AtCSLD1 和AtCSLD4 影響花粉管的發育[30]。OsCSLD4 是水稻中重要的類纖維素合酶蛋白。目前已報道了多個與OsCSLD4 等位的突變基因,其中突變基因nd1、nrl1-1、nrl1-2、nrl1-3、sle1-2 和S1-4 在基因編碼區的不同位置均發生了1 個SNP 位點變異,造成編碼蛋白有一處氨基酸置換,導致氨基酸種類發生改變[17,18,28]；S1-4 在編碼區第3 468 位上發生了G-A替換,密碼子由TGG 變為終止密碼TGA[36]。而nrl1、cd1、sle1-1 和F2-102 突變基因與OsCSLD4 差異較大,其中nrl1 在編碼區第2 179～第2 236 處有58 個核苷酸缺失[17],cd1 在編碼區第397 位有8 個核苷酸插入[37],sle1-1 在編碼區第887 ～第930 處有44 個核苷酸缺失[18],F2-102 中在編碼區第1 253 ～第1 260 處有8 個核苷酸缺失[36],上述缺失/插入突變均導致編碼蛋白發生了移碼突變。本研究發現,突變體zy103中的OsCSLD4 基因在編碼區第3 472 ～第3 479 處也有8 個核苷酸缺失,突變位點與前人并不一致,推斷可能是OsCSLD4 突變位點不同的新等位基因。

表3 定位區間內的編碼基因及其推測功能Table 3 The annotated genes and their putative functions in the target interval

圖5 OsCSLD4 基因的PCR 擴增Fig.5 PCR amplification of OsCSLD4

突變體表型分析發現,OsCSLD4 基因突變后,植株常呈現多種缺陷表型。如OsCSLD4 基因突變后,突變體sle1-1 植株表現出葉變窄微卷、株高降低、根系變短變細、根毛數減少、粒寬減小、結實率降低、花粉囊及花粉粒發育異常、氣孔的細胞發育不良等多種變異表型[18]；突變體cd1 表現出植株矮化、葉片卷曲變窄、葉角增大、結實率顯著降低、穗長及穗粒數減少、種子變小等變異表型[37]；突變體nrl1 表現出葉片變窄、微卷(內卷)、株高降低、分蘗數增加、莖稈變細、葉角增大、根系變短、穗變小、育性降低、種子寬度減小、長度增加,成熟谷粒多裂穎等變異表型[15]。本研究中、突變體zy103 也呈現葉片窄化微卷、株高降低、根系變短變少、穗變小、穗粒數減少、結實率降低、粒寬減小、多數成熟籽粒彎曲變形等多種缺陷表型,與前人結果相似。由此推測,OsCSLD4 基因可能具有多效性,其不僅參與水稻葉片形態建成,而且影響水稻其他營養和生殖器官的生長發育。

泡狀細胞是禾本科植物葉片的重要特征,它們多分布于葉片近軸面表皮的維管束間,這種細胞被認為與葉片卷曲有關。研究表明,植物葉片內卷突變體nrl1 和rl14 的葉片近軸面泡狀細胞均縮小[17,38],而葉片外卷突變體oul1 和adl1 的葉片近軸面泡狀細胞增多或增大[39-40],表明葉片近軸面表皮泡狀細胞是植物葉片卷曲的作用力來源。本研究發現,突變體zy103的葉片向內微卷,但突變體葉片的橫切面顯示出近軸面泡狀細胞增多且變大。這種近軸面泡狀細胞增多變大而葉片表現為內卷的現象,與前人研究并不一致,且目前鮮有報道,其卷葉調控機理還有待進一步研究。

4 結論

本試驗從秈稻品種9311 與粳稻品種豫粳6 號的雜交F7株系中發現窄葉突變體zy103,研究發現,與野生型親本相比,突變體zy103 表現出全生育期葉片變窄微卷,株高及結實率降低,成熟種子彎曲變形等變異表型。應用(zy103/9311)F2、F3分離群體將窄葉突變基因定位在第12 號染色體195.4 kb 的區間內,區間內編碼水稻葉形態的類纖維素合酶基因OsCSLD4 的編碼區第2 外顯子處第3 472～第3 479 處有8 個核苷酸(TGTGCCAC)缺失,造成移碼突變,推測OsCSLD4是引起突變體zy103 窄葉突變的目的基因。本研究結果為解析水稻窄葉形成的分子機理和水稻理想株型育種奠定了一定的理論基礎。