蓖麻延伸因子基因的克隆與表達分析

王 芳 董美玲 董 樂,? 王 云 朱國立 許珊珊 呂冬雪 王建穎

(1泉州師范學院海洋與食品學院,福建 泉州 362000；2內蒙古民族大學農學院,內蒙古 通遼 028042；3內蒙古通遼市農業科學研究院,內蒙古 通遼 028015)

植物應答信號網絡調控著植物的生命周期,當植物受到不同刺激時會產生不同反應,而基因表達分析是理解這一復雜網絡的重要工具[1]?；虮磉_是從DNA 到蛋白質的過程,包括轉錄和翻譯。因此,從mRNA 和蛋白質水平兩方面分析基因的表達情況,才能對信號網絡或表達模式有相對完整的理解。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)具有高特異性、高可靠性、高靈敏度、高精確度、分析速度快、對反應進程的實時監測、唯一能對低豐度mRNA 進行檢測等特點,已被廣泛應用于基因在mRNA 水平的表達差異分析[2],但RNA 的完整性、逆轉錄效率、從樣本到樣本的擴增效率、cDNA 的質量等因素均會顯著影響RT-qPCR 結果[3]。Western blot 具有高特異性、高可靠性、高靈敏度、高精確度等特點,已被廣泛應用于基因在蛋白質水平的表達差異分析,但蛋白質質量、蛋白質濃度、抗體的工作效率和特異性、轉膜質量等因素均會顯著影響Western blot 結果[4]。因此,要精確判斷特定靶基因表達的水平,除需要標準化的程序外,還需要選擇1 個適宜且穩定表達的參考基因校正目標基因的表達水平,以減小檢測樣本本身和實驗系統對定量結果的影響[5]。理想的參考基因應在所有組織、細胞類型中均有表達,在細胞組成及基本功能的維持中發揮重要作用,在不同環境和試驗條件下均能穩定表達,不受任何內外因素的影響[6]。研究表明,管家基因(housekeeping genes, HKGs)編碼的蛋白是維持細胞基本代謝所必需的,且HKGs 在任何類型的器官或組織中,在任何物種的任何發育階段或生理狀況下的表達都是恒定的[7],因此在植物基因表達分析中,一些HKGs 基因包括植物延伸因子(elongation factor, eEF)的亞基編碼基因EF-1α 常被用作參考基因[8]。

eEF 可以催化氨基酸鏈在核糖體上的延伸,從而調控相關蛋白的合成。eEF 可分為eEF1 和eEF2 兩種,其中eEF1 有4 個亞基,分別為EF-1α、EF1-β1、EF1-β 和EF1-γ,1995年4月國際生物化學與分子生物學聯盟(The International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB)委員會將其重新分別命名為eEF1A、eEF1Bα、eEF1Bβ 和eEF1Bγ,但習慣上仍沿用原命名[9]。EF-1α 是主要的翻譯因子之一,除參與蛋白質翻譯[10]外,還參與細胞骨架組成[11]以及植物對生長信號傳導、抗熱、抗旱、抗病的響應過程[12-13]。EF-1α 廣泛分布于生物體細胞內,其含量占正常細胞總蛋白的1%～3%,僅次于肌動蛋白Actin[14]。目前已有EF-1a 作為內參基因用于白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)[15]、黃瓜(Cucumis sativus L.)[16]、矮牽牛(Petunia hybrida)[17]等植物的基因表達分析的研究報道。但也有研究發現,一些植物EF-1a 的表達在不同組織器官中和在不同的生理狀態下并不是恒定不變的,如結球甘藍BoEF-Tu 的表達量在花粉萌發后期上調[18]；桐花樹AcEF1A 不僅在不同組織中的表達有顯著差異,且在低溫、高鹽、干旱、重金屬Cd 脅迫等逆境條件下也會有不同程度的上調[19]。因此,在采用EF-1α作為分子內標開展研究時,必須首先評價其在所研究物種中不同條件下表達的穩定性。

蓖麻 ( Ricinus communis L.) 為大戟科(Euphorbiaceae)蓖麻屬(Ricinus L.)一年生或多年生草本植物,具有適應性廣、抗逆性強等特點,是世界十大油料作物之一。目前EF-1α 編碼基因的研究主要集中于大豆(Glycine max)[20]、水稻(Oryza sativa)[21]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[22]等植物,蓖麻EF-1α(RcEF-1α)全長cDNA 序列雖然已被克隆并登錄GenBank(登錄號： XM_002518027.3),但其基因表達研究尚未見報道。

本研究采用RT-PCR 技術克隆蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)的編碼序列(coding sequence, CDS),構建原核表達載體pET32a(+)-RcEF-1α 并進行表達,采用表達蛋白為抗原免疫新西蘭白兔,制備抗RcEF-1α的多克隆抗血清,利用RT-qPCR 和Western blot 分析RcEF-1α 在時空一致的條件下正常生長的根、莖、雌花、雄花、果實和葉中的表達模式,探討在蓖麻功能基因研究中RcEF-1α作為內參基因的可行性,以期為蓖麻的基因表達研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蓖麻種子由內蒙古通遼市農業科學研究院提供。于泉州師范學院試驗田選取正常生長并處于盛花期的蓖麻植株(環境溫度30℃,環境濕度52%,土壤含水量46%),用滅菌的剪刀剪取一級分枝花序雌花,用于提取克隆RcEF-1α CDS 所用的總RNA,剪取植株根、莖、葉、一級分枝花序雌花、一級分枝花序雄花和主莖花序果實,用于提取組織表達分析所用的總RNA 和總蛋白質。

1.2 方法

1.2.1 不同組織總RNA 和總蛋白的提取 采用TRIzol? Reagent(Ambion,USA)試劑盒分別提取蓖麻各組織的總RNA,其質量和濃度通過2%瓊脂糖凝膠電泳 和 Eppendorf Biophotometer Plus 檢 測； 采用MinuteTMTotal ProteinEextraction Kit ( Invent Biotechnologies,北京)試劑盒分別提取蓖麻各組織的總蛋白質。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(Beyotime,上海)測定各組織總蛋白濃度。

1.2.2 mRNA 的純化和cDNA 第一鏈的合成 采用Oligotex? mRNA Mini Kit 試劑盒(Qiagen,USA)純化mRNA；采用Reverse Transcription System(Promega,北京)合成cDNA 第一鏈。

1.2.3 RcEF - 1α 原核表達載體的構建 根據GenBank 中登錄的蓖麻RcEF-1α 的全長編碼區序列設計1 對特異性引物(含BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點),以此進行PCR 擴增得到RcEF-1α CDS 序列,引物序列如下：P1： 5′-CGCGGATCCATGGGTAAGGAGA AGATTCGC(下劃線為BamH Ⅰ識別位點)；P2：5′-CC GCTCGAGTTTTCCTCCCTTCTTGG(下劃線Xho Ⅰ識別位點),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以蓖麻雌花的cDNA 第一鏈為模板,進行RTPCR,PCR 產物經凝膠電泳檢測后,目的條帶用QIAquick? Gel Extraction Kit(Qiagen,USA)回收純化。純化的PCR 產物和pET32a(+)載體分別經雙酶切(用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ)得產物,按試劑盒說明書分別進行凝膠回收,再將2 個回收產物用T4 DNA 連接酶連接(NEB,USA)。把連接產物轉化到E.coli DH5α,菌落在含氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside,IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloroindol-3-yl-β-D-galactopyranoside,XGal)的選擇培養基上培養后,挑選陽性菌落分別培養,采用QIAprep? Spin Miniprep Kit 試劑盒(Qiagen,USA)提取質粒,并通過雙酶切鑒定篩選陽性重組質粒。經酶切鑒定的陽性重組質粒pET32a(+)-RcEF-1α 送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

PCR 反應體系為50 μL,其中包括10 μL 5×Buffer、4 μL 50 mmol·L-1MgCl2、2 μL 50 mmol·L-1dNTP、0.5 μL 0.8 unit·μL-1Taq DNA polymerase、0.5 μL 10 mmol·L-1P1、0.5 μL 10 mmol·L-1P2、0.5 μL cDNA。PCR 反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,35 個循環；72℃延伸10 min。

1.2.4 序列分析 利用DNAMAN 對RcEF-1α 的ORFCDS 序列、氨基酸編碼序列進行分析。

1.2.5 pET32a(+)-RcEF-1α 原核表達條件分析 將經測序鑒定的重組質粒pET32a(+)-RcEF1-α 和空質粒分別轉化E.coli BL21。挑選重組菌株和空菌株,分別在37℃、200 r·min-1條件下于LB 培養基中過夜培養。新鮮菌液經PCR 擴增檢測后按1 ∶50 比例接種至含有Amp(50 mg·L-1)的LB 液體培養基中,于37℃、200 r·min-1條件下培養至吸光度A600nm處于0.6～0.7 之間,加入IPTG 至終濃度為1.2 mmol·L-1,同時設未誘導對照,誘導表達后終止培養。分別取各不同誘導條件下的1 mL 菌液,于10 000 r·min-1離心10 min 收集菌體,加入100 μL 磷酸鹽緩沖液重懸,然后分別加入25 μL 5×SDS 凝膠加樣緩沖液,100℃煮沸5～10 min 后分別取20 μL 上樣,其余菌體置于-20℃貯存備用。經SDS-PAGE 電泳,凝膠配制質量分數為5%的濃縮膠(pH 值6.8)和12%的(pH 值8.8)分離膠,電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液(pH 值8.3)?？捡R斯亮藍R250 染色2 h 后脫色過夜,拍照觀察。

通過預試驗確定誘導pET32a(+)-RcEF-1α 表達量的基本條件為誘導溫度28℃、誘導時間6 h、IPTG誘導濃度為1.2 mmol·L-1。通過固定其他條件只改變其中一個條件來分析各單因素對pET32a(+)-RcEF-1α 表達量的影響。設置誘導溫度分別為4、16、28、37℃,誘導時間分別為0、1、2、4、6、8、10 h,IPTG 誘導濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol·L-1。

1.2.6 融合蛋白His-RcEF-1α 可溶性分析 按1.2.5 確定的條件培養表達pET32a(+)-RcEF-1α,并收集誘導表達的菌體,以原培養液1 ∶50 體積的磷酸鹽緩沖液懸浮,加入溶菌酶至終濃度100 μg·mL-1,冰浴中超聲裂解,每次裂解2 s,間隔2 s,共3 min。重復以上裂解步驟30 次,然后于4℃、12 000 r·min-1離心10 min,分離上清和沉淀,用SDS-PAGE 分析pET32a(+)-RcEF-1α 的表達形式。

1.2.7 融合蛋白His-RcEF-1α 的純化及特異性分析 融合蛋白His-RcEF-1α 用BeaverBeadsTMHis-tag Protein Purification(蘇州BeaverBeads 公司)純化,特異性分析按文獻[23]進行。其中,一抗為鼠抗His 單克隆抗體(Biomiga,USA),稀釋倍數為1 ∶5 000；二抗為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的羊抗鼠IgG(Tiangen,北京),稀釋倍數為1 ∶10 000,用WesternBrightTMECL(Advansta,USA)曝光充分顯色后拍照并保存。

1.2.8 RcEF-1α 抗體的制備 用純化的His-RcEF-1α與相同體積的完全弗氏佐劑(Sigma,USA)徹底混勻,免疫新西蘭兔。14 d 后,用His-RcEF-1α 與相同體積的不完全弗氏佐劑(Sigma,USA)再免疫1 次,隔14 d再加強免疫1 次,總計免疫3 次。第2 和第3 次免疫前從耳緣靜脈采血,第3 次免疫后再經過14 d,用ELISA 法[24]檢測效價后,頸動脈插管取血,離心分離血清,分裝后于-80℃保存。

1.2.9 RcEF-1α 抗體的效價分析 采用ELISA 法檢測His-RcEF-1α 免疫新西蘭兔的抗血清效價時,以抗原包被液作為空白對照,未免疫的兔血清作為陰性對照。

1.2.10 RcEF-1α 抗體的特異性分析 以純化的His-RcEF-1α 為抗原,His-RcEF-1α 抗血清作為一抗(1 ∶20 000), HRP 標 記 的 抗 兔 IgG 為 二 抗(1 ∶10 000)；以蓖麻雌花總蛋白為抗原,His-RcEF-1α抗血清作為一抗(1 ∶4 000),HRP 標記的抗兔IgG 為二抗(1 ∶5 000),分別用WesternBrightTMECL Kit 曝光充分顯色,拍照并保存。

1.2.11 RcEF-1α 在蓖麻各組織的表達 分別提取蓖麻盛花期植株的根、莖、葉、雌花、雄花和果實組織的RNA 后進行RT-qPCR。引物序列如下,qRcEF1α1：TGTCCTCAAGCCTGGTATG； qRcEF1α2： TTCCTTGGC AGGATCATC,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RT-qPCR 反應體系(總體積15 μL),包括Mix 7.5 μL,qRcEF1α1 0.15 μL,qRcEF1α2 0.15 μL,cDNA 1.5 μL,RNase Free ddH2O 補足至15 μL。在StepOnePlusTMReal-Time PCR System(ABI,USA)上擴增。擴增程序：50℃預變性2 min；95℃變性10 min,95℃退火15 s,60℃延伸1 min,40 個循環。PCR 擴增產物經電泳檢測后進行數據分析。用2-ΔΔCT法[25]計算RcEF-1α mRNA 相對表達水平。每個樣品重復3 次。以雌花的表達水平作對照。

提取根、莖、葉、雌花、雄花和果實中的總蛋白,蛋白質含量按文獻[26]的方法測定。每個組織分別取1 mg 蛋白質,用SDS-PAGE(12%分離膠)分析其表達水平。RcEF-1α 在蓖麻各組織中的表達情況用Western blot 檢測,一抗為自制RcEF-1α 抗血清(稀釋倍數為1 ∶4 000),二抗為HRP 標記的抗兔IgG(稀釋倍數為1 ∶5 000),用WesternBrightTMECL Kit ECL 發光試劑盒曝光充分顯色,拍照并保存。每次試驗設3 次生物學重復,每個生物學重復至少進行3 次技術重復[27]。以雌花的表達水平作對照。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2010 統計數據；采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 pET32a(+)-RcEF-1α 的構建及鑒定

蓖麻雌花總RNA 電泳檢測結果表明,總RNA 的完整性良好(圖1-A),可作模板用于合成cDNA。以cDNA為模板,用設計合成的擴增CDS 的引物進行RT-PCR,PCR 產物經電泳鑒定后將預期大小的PCR 產物(圖1-B)回收?；厥债a物與pET32a(+)分別雙酶切(用BamHⅠ和XhoⅠ),酶切產物進行電泳(凝膠瓊脂糖濃度為1.5%)(圖1-C)。RcEF-1αCDS 和pET32a(+)的酶切產物分別回收后進行連接(用T4DNA 連接酶)。連接產物轉化E.coli DH5α,選取白色單克隆菌落放大培養后提質粒。重組質粒經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后進行電泳檢測,酶切后獲得分別與pET32a(+)和插入目的片段的大小相符的DNA 片段,挑選陽性重組質粒測序(圖1-D)。序列分析表明,該DNA 片段長度為1 347 bp,序列與預期序列一致,說明重組質粒pET32a(+)-RcEF-1α構建成功(圖2)。

圖1 RcEF-1α 基因重組表達載體質粒構建的電泳圖譜Fig.1 The electrophoresis pattern of the recombinant expression vector of RcEF-1α

2.2 pET32a(+)-RcEF-1α 原核表達及可溶性分析

重組菌pET32a(+)-RcEF-1α 經菌落PCR 檢測(圖3)為陽性后,隨機挑取多個陽性菌落,添加IPTG誘導培養表達。由圖4-A 可知,隨著誘導溫度的升高,pET32a(+)-RcEF-1α 表達量呈先增加(至28℃時達最高)后降低,因此最佳誘導溫度為28℃；由圖4-B 可知,處理時間為6 h 時表達量最高,故誘導時間選擇6 h；誘導表達量在IPTG 濃度為0.7 mmol·L-1時最高(圖4-C),故IPTG 誘導濃度選擇0.7 mmol·L-1。用0.7 mmol·L-1IPTG 誘導重組菌表達后,離心收集菌體,超聲波裂解菌體,用SDS-PAGE 分析裂解后的上清和沉淀,pET32a(+)-RcEF-1α 表達蛋白主要存在菌體裂解液沉淀中,即主要以包涵體形式存在(圖4-D)。

His-RcEF-1α 純化產物經SDS-PAGE 驗證,在凝膠泳道上顯示目的蛋白的單一條帶(圖4-D、圖5)。經Western blot 驗證,在純化蛋白的泳道上只出現一條接近66 kD 的條帶,可見有特異性抗原—抗體結合物,說明His-RcEF-1α 表達成功(圖5)。

2.3 RcEF-1α 抗體的效價與特異性分析

圖2 蓖麻RcEF-1α CDS 序列和推斷的氨基酸序列Fig.2 The CDS and amino acid sequences of RcEF-1α from R.communis

圖3 pET32a(+)-RcEF-1α 原核表達菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophotesis analysis of colony PCR product of pET32a(+)-RcEF-1α

以純化的His-RcEF-1α 為抗原免疫新西蘭兔,制備兔抗His-RcEF-1α 的多克隆抗血清。將免疫的兔抗血清用半倍稀釋法稀釋后,陰性對照為未免疫的兔血清,用ELISA 檢測其效價,樣品陽性孔的判斷取決于比值=樣品孔的吸光度值(P)/陰性樣品孔的吸光度值(N),當P/N＞2.1 時,樣品為陽性。結果表明,His-RcEF-1α 的兔抗血清效價為1 ∶51 200(圖6)。

由圖7 可知,一抗為His-RcEF-1α 抗血清、二抗為HRP 標記的抗兔IgG,當抗原分別為原核表達純化產物His-RcEF-1α 和蓖麻花總蛋白時,Western blot 分析表明,該抗血清不僅可特異性識別經IPTG 誘導在大腸桿菌中表達并純化的His-RcEF-1α,還可特異性識別蓖麻花總蛋白。

2.4 RcEF-1α 基因在蓖麻各組織的表達

由圖8 可知,RcEF-1α 在蓖麻根、莖、葉、雌花、雄花和果實均有表達,但在各組織中的mRNA 表達量差異不顯著；Western blot 分析結果表明,在蓖麻根、莖、葉、雌花、雄花和果實中,RcEF-1α 蛋白相對含量存在顯著性差異,其中雌花和雄花中蛋白相對含量顯著高于其他組織,根和莖中蛋白相對含量明顯低于其他組織(圖9)。

3 討論

EF-1α 作為傳統的HKGs 之一,常被用作基因表達分析中的參考基因[7]。本研究結果表明,RcEF-1α在時空一致條件下,在蓖麻根、莖、葉、雌花、雄花和果實中表達穩定,這與EF-1α 在白菜[15]、黃瓜[16]、矮牽牛[17]等植物中的研究結果一致,但EF-1α 在玉米(Zea rnays)[28]、白骨壤(Avicennia marina)[29]、甘蔗(Saccharum officinarum)[30]、 鹽 地 堿 蓬( Suaeda salsa)[31]、桑樹(Morus alba)[32]和馬鈴薯(Solanum tuberosum)[33]中的表達卻均不穩定。因此,在利用RT-qPCR 和Western blot 進行目的基因表達的研究時,應根據不同的試驗條件、試驗樣品來篩選適宜的、穩定的參考基因[21]。任何一個參考基因的穩定表達都是相對的,同一物種同一內參基因的穩定性,在不同生理條件下通常并不穩定,而在不同物種中同源參考基因也沒有絕對的通用性,穩定性也不完全相同[34-35]。在基因表達分析中,選擇一個表達穩定的基因作為參考基因至關重要[35]。某基因即便于一定的生理條件下在轉錄水平上穩定表達,但由于基因表達的復雜網絡調控系統的變化,也可能導致其在翻譯過程中存在顯著差異。因此,基因表達分析時所用的參考基因應該是特定物種在特定處理中mRNA 水平和/或翻譯水平都相對穩定表達的基因。

圖4 pET32a(+)-RcEF-1α 原核表達條件的優化SDS-PAGE 圖譜Fig.4 SDS-PAGE analysis of optimization of prokaryotic expression conditions of pET32a(+)-RcEF-1α

本研究從mRNA 和蛋白質水平對RcEF-1α 的表達進行了初步分析,但僅分析了時空一致條件下RcEF-1α在蓖麻6 種組織中的表達模式,提供的信息并不全面。RcEF-1α 能否作為或在什么樣的試驗條件下可作為參考基因,還需通過分析不同時空條件下該基因詳細的mRNA 和蛋白質表達模式來進行綜合評價。

圖5 純化His-RcEF-1α 的SDS-PAGE 圖譜和Western blot 驗證Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of purified His-RcEF-1α

圖6 ELISA 檢測RcEF-1α 抗體的效價Fig.6 The titer of RcEF-1α antibody by ELISA

圖7 多克隆抗血清特異性的Western blot 分析Fig.7 Western blot analysis of polyclonal immune serum

圖8 RcEF-1α mRNA 在蓖麻不同組織中的表達量Fig.8 Expression pattern of RcEF-1α mRNA in different tissues from R.communis

圖9 RcEF-1α 蛋白質在蓖麻不同組織中的表達量Fig.9 Expression pattern of RcEF-1α protein in different tissues from R.communis

4 結論

本研究采用RT-PCR 技術克隆RcEF-1α CDS,構建原核表達載體pET32a(+)-RcEF-1α,結果表明在66 kD 處有RcEF-1α 蛋白表達,將原核表達的RcEF-1α 蛋白進行純化得到單一的RcEF-1α 蛋白,并以此作為抗原免疫小鼠,制得效價為1 ∶51 200 且特異性好的多克隆抗血清；以多克隆抗血清為一抗,通過Western blot 分析RcEF-1α 在時空條件一致且正常生長的根、莖、葉、雌花、雄花和果實中的表達量,結果顯示,蓖麻各組織中RcEF-1α 蛋白質的含量存在顯著差異,其中雌花和雄花中的含量顯著高于其他組織。RT-qPCR 分析結果表明,蓖麻各組織中RcEF-1α mRNA 差異不顯著。本研究結果為蓖麻基因表達分析研究提供了一定的理論依據。