蘋果異戊烯基轉移酶基因啟動子調控特性研究

杜傳慧 付 艷 王利敏 仇占南 李晨輝 朱元娣

(中國農業大學園藝學院,北京 100193)

目前,轉基因技術所應用的靶基因多為異源基因,轉基因產物中不僅含有轉入的靶基因,也攜帶抗生素選擇標記基因(新霉素磷酸轉移酶nptII 基因、潮霉素磷酸轉移酶HYG 基因、抗除草劑als 基因等)、異源報告基因(β-葡糖苷酸酶GUS 基因、綠色熒光蛋白GFP基因、熒光素酶LUC 基因等)和載體的骨架序列[1]。這種傳統的異源轉基因技術打破了物種間的生殖隔離,改變了原有物種的基因庫,故人們對轉基因作物的安全性提出了質疑[2]。為了避免轉基因作物對人類及環境安全造成潛在危害,Nielsen[3]提出了同源轉基因的概念,即根據物種進化關系,目的基因來源于本物種或雜交親和的近緣物種的轉基因技術。且同源轉基因作物不含有外源基因、抗性篩選基因和載體骨架序列[4-5]。此外,同源轉基因不改變物種基因庫,消除了外源基因滲入可能產生的生態環境和人類健康安全隱患,與常規雜交育種方法相似,無不良的連鎖累贅,育種效率高,更容易被消費者接受[6-7]。

異戊烯基轉移酶(isopentenyl transferases, TPT)是細胞分裂素生物合成途徑中的第一限速酶,通過調控內源細胞分裂素水平以調控植株的生長發育[8]。Smigocki 等[9]將農桿菌Ti 質粒中的ipt 基因,分別連接在CaMV 35S 啟動子和ipt 自主啟動子上轉化煙草(Nicotiana tobacum L.),進一步觀察發現,轉基因煙草的內源細胞分裂素含量前者是后者的23 倍,分枝數量前者是后者的6 倍,且過表達ipt 基因可以通過提高內源細胞分裂素水平加快細胞完成芽器官發生的過程。CaMV 35S 啟動子驅動的ipt 基因轉化煙草[10]、水稻(Oryza sativa L.)[11]和白楊(Populus sieboldii×Populus grandidentata)[12]獲得側芽增多的轉基因表型,以這種細胞分裂素特異的表型作為篩選標記,可以直接篩選出轉基因株系,避免使用抗生素或除草劑的選擇標記。常規轉基因多采用來源于花椰菜花葉病毒的強組成型啟動子CaMV 35S,但其不能保證轉基因植株的安全性[13]。此外,在聚合育種中,多個基因使用相同的啟動子,可能會導致同源性基因沉默[14],且轉基因的強表達會影響植物本身的代謝平衡和正常的生長發育[15]。因此,采用植物啟動子或基因自主的啟動子替代異源強啟動子,可有效地對傳統的轉基因技術進行改良。

MdIPT3a 是蘋果(Malus×domestica Borkh.)MdIPTs家族的一個功能基因,在蘋果營養器官和生殖器官均有表達,過量表達該基因的轉基因煙草表現出典型的細胞分裂素特異的生長表型[16-17],即此表型可作為蘋果同源轉基因的潛在篩選標記。為探究MdIPT3a 基因的有效啟動子長度,本研究克隆了不同長度的MdIPT3a 基因上游調控序列片段,構建MdIPT3a 自主啟動子驅動GUS 基因的植物表達載體,遺傳轉化煙草Wisconsin 38,通過組織染色及半定量PCR 方法,定量和定性分析GUS 基因的表達,研究MdIPT3a 啟動子對基因表達的影響,以期明確MdIPT3a 啟動子的功能,為實現MdIPT3a 的蘋果同源轉基因提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 采集富士蘋果10年生樹葉片。煙草Wisconsin 38 組培苗為中國農業大學園藝學院果樹系朱元娣老師課題組保存,繼代培養基為添加3%蔗糖和0.65%瓊脂的MS 培養基。

1.1.2 載體、菌株及主要試劑 載體pMD19-T Simple、載體pMD18-T 以及大腸桿菌DH5α 感受態細胞均購自寶生物(大連) 工程有限公司； 載體pCAMBIA1391、根癌農桿菌菌株EHA105 為中國農業大學園藝學院朱元娣保存。DNA 片段凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自北京三博遠志生物技術有限公司；premix Taq version 2.0、premix Taq LA Taq version、T4 DNA 連接酶和PrimeScriptTMStrand cDNA Synthesis Kit 購自TaKaRa(日本)公司；限制性內切酶購自NEW ENGLAND Biolabs(北京),其他試劑均為國產分析純；引物合成和DNA 測序均由北京三博遠志生物技術公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 富士蘋果基因組DNA 的提取 采用CTAB法[18]提取富士蘋果葉片DNA。

1.2.2 MdIPT3a 基因啟動子的克隆和表達載體構建在蘋果基因組數據庫(https：/ /www.rosaceae.org/)中分析MdIPT3a(GenBank 登錄號：LOC103432442)的上游序列,據此設計引物MdIPT3a P1-F/R(GGCACTA AATGTAAATAAAGGTGT/GGACTAGTCATGCTGGTGA TGATCAAATACTTTATCTG,ACTAGT為SpeⅠ酶切位點,下同),PCR 擴增產物為2 739 bp。以富士蘋果基因組DNA 為模板,進行PCR 擴增。PCR 反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸3 min,35 個循環；72℃延伸7 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收純化目的條帶,連接pMD18-T 載體,轉化大腸桿菌后測序。

利用啟動子核心區域分析網站BDGP(Berkeley Drosophila Genome Project,http：/ /www.bdgp.org/)、啟動子元件分析網站PlantCARE(http：/ /bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/plantcare/html/)對MdIPT3a 基因上游調控序列進行核心元件分析[16]。

依據 MdIPT3a 基因啟動子序列和載體pCAMBIA1391 上的酶切位點,設計特異引物擴增長度不同的上游調控序列。啟動子P1 代表MdIPT3a 基因的上游2 739 bp 的序列片段；P2 代表基因上游1 512 bp 的序列片段,特異引物MdIPT3aP2-F/R(CCCAAGCTTCTCACTATCCTGCAATCTGT/GGACTAGT CATGCTG GTGATGATCAAATACTTTATCTG,AAGCTT為Hind Ⅲ酶切位點,下同)；P3 代表基因上游949 bp 的序列片段,MdIPT3aP3-F(CCCAAGCTTAAATCCACTGTATGC GAAG/GGACTAGTCATGCTGGTGATGATCAAATACTT TAT C TG)；P4 代表基因上游446 bp 的序列片段,MdIPT3aP4-F/R(CCCAAGCTTATTTCCTTTTTTTTCTA CCTCCACAG/GGACTAGTCATGCTGGTGATGATCAAA TACTTTATCTG)。

以富士蘋果基因組DNA 為模板,進行PCR 擴增,程序同上。取測序正確的陽性菌菌液200 μL,提取質粒。將載體pCAMBIA1391 和啟動子回收質粒分別進行雙酶切,分別將各啟動子片段與pCAMBIA1391 載體進行雙酶切反應,并回收純化,再將各啟動子片段與pCAMBIA1391 載體用T4 連接酶16℃條件下過夜連接。

1.2.3 煙草的遺傳轉化 在超凈工作臺中,將重組質粒10 μL(約1 μg)與100 μL 農桿菌感受態細胞于冰上輕輕混勻,靜置30 min,立即放入液氮中冷凍1 min,隨即轉入37℃水浴5 min,在上述盛有菌液的離心管中加入1 mL YEP 液體培養基(不含抗生素)于28℃、200 r·min-1條件下振蕩培養4 ～5 h 后,吸取菌液100 μL 涂布于YEP 平板[添加50 mg·L-1卡那霉素(Kana)和75 mg·L-1利福平(Rif)],28℃培養40 h,采用PCR 鑒定陽性菌株。

將陽性菌株按體積比1 ∶100 接種于添加50 mg·L-1Kana 和50 mg·L-1Rif 的YEP 液體培養基中,28℃、200 r·min-1振蕩培養至菌體的OD600值介于0.6～0.8。將菌體裝入無菌的50 mL 離心管中,5 000 r·min-1離心10 min,棄上清后用1/2 體積的MS 懸浮液(pH 值7.0,添加100 μmol·L-1的乙酰丁香酮)重新懸浮菌體。采用葉盤法[19]侵染煙草,黑暗條件下共培養3 d,然后轉入煙草葉片再生培養基[MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8.2 g·L-1+潮霉素(Hyg)10 mg·L-1+頭孢霉素(Cef)400 mg·L-1,pH 值5.8],每兩周繼代培養1 次。不定芽再生后,轉入生根培養基[MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉8.2 g·L-1+ Cef 500 mg·L-1,pH 值5.8],每月繼代培養1次。

1.2.4 轉基因植株的GUS 組織學染色分析 選取生根培養20 d 后,生長狀態一致的各轉基因系的煙草組培苗各3 株,采集不定芽、幼葉、展開葉、幼莖和根進行GUS 組織染色[20]。以X-gluc 為反應底物配制GUS 染色液,將待檢樣品浸泡于分裝好的GUS 染色液中,37℃黑暗條件下孵育1 ～2 d。將染色后的樣品取出,用70%乙醇37℃脫色,用適量去離子水清洗后在RHST60-2L 解剖鏡(福建睿鴻光電科技有限公司)下觀察染色情況。

1.2.5 轉基因植株的GUS 基因表達檢測 以生根培養20 d 的轉基因煙草組培苗為試驗材料,分別采集地上部(含芽、葉、莖)和地下部(根),利用改良的CTAB法[21]提取RNA,并用NanoDrop2000/2000c 微量紫外分光光度計(賽默飛,美國)檢測RNA 純度和濃度。取1 μg RNA 用于反轉錄合成cDNA 第一鏈。反轉錄過程按照寶生生物(大連)有限公司PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 的操作說明書進行。以煙草肌動蛋白Actin 基因(G-eneBank 登陸號：U60495)為內參基因,設計引物Actin-F/R(AAGGGATGCGAGGATGG A/CAAGGAAATCACCGCTTTGG),PCR 擴增產物為105 bp。根據載體中GUS 基因序列信息,設計引物GUSF/R(GGGCAACAAGCCGAAAGA/GTGTGAGCGTCGC AGAACATTA),PCR 擴增產物為258 bp。

以轉基因煙草樣本的cDNA 為模板,以煙草Actin為內參基因,通過Actin 調整各樣本cDNA 模板用量,對轉基因植株的地上部(芽、葉、莖)和地下部(根)進行半定量RT-PCR 擴增。PCR 反應體系為Ex Taq 酶5 μL,正反引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL,cDNA 0.5 μL,ddH2O 補足至10 μL。RT-PCR 擴增程序：94℃預變性5 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,35 個循環；72℃延伸5 min。取10 μL PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以Actin 為內參基因,用Lane 1D 凝膠分析系統進行半定量灰度分析,以灰度比值(目的條帶光密度值/Actin 條帶光密度值)代表GUS 基因的表達強度；用SPSS Statistics 軟件對GUS基因的相對表達量進行單因素方差分析,分別比較轉基因煙草地上部和地下部的GUS 表達量差異。

2 結果與分析

2.1 富士蘋果MdIPT3a 基因啟動子序列分析

將克隆的MdIPT3a 基因上游序列在BDGP 網站預測轉錄起始位點,并在PLANTCARE 網站(http：/ /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)上進行啟動子元件的分析。MdIPT3a 基因的啟動子中含有特征元件TATA-box 和CAAT-box,未發現GCbox。啟動子中含有多個光響應元件(Box4、Sp1、MRE、GT1-motif 和Ⅰ-box,其中MRE 是MYB 的結合位點)、晝夜節律調控元件Circadian、參與防御及脅迫應答的元件TC-rich repeats、真菌響應元件Box-W1、低溫響應元件LTR、熱激響應元件HSE、生長素響應元件TGAelement、乙烯響應元件ERE、水楊酸響應元件TCAelement、胚乳表達所需的元件Skn-1-motif 以及芽特異表達元件as-2-box 等(圖1、表1)。

在BDGP 網站預測轉錄起始位點,得到3 個可能性較大的預測結果,分別位于翻譯起始密碼子ATG上游的-508、-322 和-205 bp 處。PLANTCARE 網站的預測結果位于翻譯起始密碼子上游-508 bp(序列為CAAATCA)和-322 bp(序列為TACACGA,A 為預測的轉錄起始位點),推測富士蘋果MdIPT3a 基因可能從翻譯起始密碼子上游-322 bp 處起始轉錄(圖1)。

2.2 轉基因煙草的GUS 染色檢測

轉基因煙草GUS 染色結果顯示,同一轉基因系的不同株系之間的GUS 染色結果差異不明顯；不同轉基因系之間的GUS 染色結果差異明顯,不同長度MdIPT3a 啟動子驅動的GUS 基因均能夠在轉基因煙草中表達,但較對照CaMV35S 啟動子驅動的GUS 基因表達弱,CaMV35S 啟動子驅動的GUS 在不定芽、幼葉、展開葉、幼莖和根中表達最強。MdIPT3aP1 和MdIPT3aP2 的轉基因煙草中所檢測的器官組織均有表達,幼葉GUS 染色明顯,其他器官中染色較淺；MdIPT3a P3 轉基因煙草的不定芽、幼葉、展開葉和根中染色都較明顯；MdIPT3a P4 染色結果中不定芽和幼葉染色明顯,其他器官較淺。比較不同長度的MdIPT3a 啟動子驅動的GUS 表達可知,MdIPT3aP3 轉基因煙草中GUS 染色明顯,GUS 表達水平高(圖2)。

表1 蘋果MdIPT3a 基因的啟動子順式作用元件分析Table 1 The analysis of cis-acting elements of apple MdIPT3a promoter

2.3 轉基因煙草的GUS 基因表達分析

構建長度分別為2 739、1 512、949、446 bp 的MdIPT3a 自主啟動子驅動GUS 的表達載體(圖3-A)。半定量RT-PCR 結果顯示,轉基因煙草的地上部和地下部中均檢測到GUS 基因表達,MdIPT3a 的4 個不同長度的啟動子均可以驅動GUS 基因表達,CK 中CaMV 35S 驅動的GUS 表達量,在地上部和地下部均顯著高于MdIPT3a 的4 個自主啟動子驅動的GUS 表達量。轉基因煙草中MdIPT3a P3 驅動的GUS 基因表達量顯著高于MdIPT3a P1、MdIPT3a P2 和MdIPT3a P4,且這3 個啟動子驅動的GUS 表達量無顯著差異,地上部和地下部的GUS 表達結果一致(圖3-B)。

3 討論

植物啟動子在基因表達調控中起著關鍵作用,核心啟動子大約在轉錄起點-40 ～+50 bp 之間,具有結合并控制轉錄起始前復合物的裝配、定位轉錄起始位點并控制轉錄的方向、對細胞內臨近或遠處的激活子或抑制子做出響應等功能[22-23]。研究表明,植物基因的轉錄起始區具有共同的結構模式,腺嘌呤A 為轉錄起點,標記為0,兩側多為嘧啶堿基,在轉錄起點上游-25～-30 bp 處有TATA 序列,-70 ～-78 bp 處有CAAT,-80～-110 bp 區含有GC 盒,TATA 和上游的保守序列共同作用確保精確而有效地起始轉錄[24-25]。本研究預測MdIPT3a 啟動子有2 個轉錄起始位點,分別是起始密碼子 ATG 上游- 508 bp (序列為CAAATCA)和-322 bp(序列為TACACGA)。TATAbox 在起始密碼子上游-347～-354 bp,CAAT-box 在起始密碼子上游-391 ～-395 bp,分別與預測的第一個-322 bp的轉錄啟始點相距25 bp 和69 bp,與前人對植物基因啟動子的結構模式的研究結果一致。第2 個預測的轉錄起始位點(起始密碼子上游-508 bp)與其上游的TATA-box(起始密碼子上游-528 ～-535 bp)和CAAT-box(起始密碼子上游-602 ～-605 bp)分別相距20 bp 和94 bp,轉錄起點兩側多為腺嘌呤,非嘧啶堿基,與植物基因啟動子的結構模式不符,推測MdIPT3a 從起始密碼子上游-322 bp 處起始轉錄。GUS 染色和半定量RT-PCR 分析結果表明,長度為446 bp 的MdIPT3a 啟動子能夠驅動GUS 基因表達,進一步驗證了MdIPT3a 可能從起始密碼子上游-322 bp處起始轉錄。

圖1 富士蘋果MdIPT3a 基因上游序列順式作用元件分析Fig.1 Analysis of cis acting elements in the upstream sequence of MdIPT3a gene from apple cultivar Fuji

啟動子通過順式作用元件來調控基因的表達,因此啟動子的長度可以影響基因的表達水平,這與不同長度的啟動子所包含的順式作用元件的多少和類型有關[26-27]。如蘋果黑星病抗性基因HcrVf2 的不同啟動子長度影響轉基因蘋果的抗性水平,短啟動子(115 bp)驅動效率最低,288 bp 的驅動效率最高,長啟動子(779 bp)介于二者之間[27-28]。此外,對序列分析發現,115 bp 啟動子只包含一個TATA-box 和預測的轉錄起始位點,而288 bp 的啟動子還包含1 個CAATbox、2 個DOF 元件(與Dof 轉錄因子結合)、光調控元件(1 個GATA 元件、3 個GT-1 元件、2 個Ⅰbox),779 bp 啟動子包含的順式元件的數量和種類較288 bp 更多[28]。本研究中,不同長度的MdIPT3a 啟動子均能驅動GUS 基因在轉基因植株地上部和地下部中表達,且以MdIPT3aP3 驅動基因表達的能力最強,說明啟動子的長度影響了基因的表達水平。MdIPT3a 基因上游序列存在多個順式作用元件,在生物及非生物脅迫影響下調控基因的表達,且很多響應元件以多拷貝形式存在, 可能具有增強防御響應調控作用[29-30]。MdIPT3aP1 作為最長的自主啟動子,GUS 染色較淺和GUS 表達量較低,可能與順式作用元件多且調控基因表達的因素較多相關。MdIPT3aP4 是最小的啟動子,含預測的轉錄起始位點、TATA-box 和CAAT-box,具有啟動 子 的 核 心 結 構, 能 夠 驅 動 GUS 表 達。與MdIPT3aP4 相比,啟動子MdIPT3aP3 還包含1 個真菌響應元件Box-W1、2 個晝夜節律調控元件Circadian、2個脅迫響應元件TC-rich repeats、1 個胚乳表達必需元件Skn-1-motif 和1 個蛋白質結合位點BoxⅢ,在本研究所設計的4 個啟動子中驅動基因表達效率最高,與前人關于黑星病抗性基因HcrVf2 啟動子的研究結果一致[27-28]。

圖2 轉基因植株不同組織中GUS 表達分析Fig.2 The analysis of GUS expression in different tissues of transgenic tobaccos

由于IPT 基因作為標記基因轉入植物體會打破植株的頂端優勢,使側芽萌發過量,造成生長發育畸形[10],因此同源轉基因中除了要使用基因自主啟動子外,還要將標記基因刪除。通過GST-MAT 載體系統中R 重組酶[31-32]或化學調控DNA 特異位點的切除系統[33],可獲得無外源基因的轉基因植株[34]。若將本研究中MdIPT3a 基因自主啟動子與無標記轉基因或同源轉基因技術相結合,可進一步優化蘋果的遺傳轉化,提高育種效率。

4 結論

圖3 不同長度MdIPT3a 啟動子和GUS 融合基因的構建(A)及轉基因植株的GUS 表達(B)Fig.3 Constructs of MdIPT3a promoters and GUS fusion genes with different lengths (A)and GUS expression in transgenic plants(B)

本研究推測MdIPT3a 可能從起始密碼子上游-322 bp 處起始轉錄,4 個不同長度的MdIPT3a 基因啟動子驅動GUS 基因表達量顯著低于CaMV35S 啟動子,MdIPT3a P3 驅動效率高于其他3 個MdIPT3a 啟動子。4 個MdIPT3a 啟動子中,最短的有效啟動子長度為446 bp,包含預測的轉錄起始位點、TATA-box、CAAT-box、ELI-box3 和Box-W1,但MdIPT3a 基因的最短有效啟動子長度尚需設計更短的啟動子來進一步驗證。本研究結果為蘋果的同源轉基因的發展奠定了一定的理論基礎。