基于轉錄組信息的黑果枸杞WD40蛋白質家族分析

嚴 莉 陳建偉 王翠平,? 仝 倩 王 晨 喬改霞 李 健

(1寧夏大學生命科學學院,寧夏 銀川 750021；2寧夏林業研究院種苗生物工程國家重點實驗室,寧夏 銀川 750004)

WD40 蛋白質又稱WD40 重復體,廣泛存在于真核生物中,在原核生物中極少見[1]。WD40 蛋白質中的WD40 基序高度保守,通常約含40 ～60 個氨基酸殘基,在其N 末端含有甘氨酸-組氨酸(GH)二肽,C 末端含有色氨酸-天冬氨酸(WD)二肽,中間被可變區域隔開[2-5]。WD40 基序可作為蛋白質-蛋白質及蛋白質-核酸相互作用的支架[6],多數WD40 蛋白質包含至少由4 個WD40 基序折疊形成的β 螺旋槳結構,并通過該結構發揮作用[7]。

研究表明,WD40 蛋白質廣泛存在于細胞質和核質中,參與多種重要的細胞過程[8],包括信號轉導[9]、基因轉錄調控[10]、細胞骨架動力學[11]、膜泡運輸[12]、DNA 損傷及修復[13]、細胞死亡和細胞周期調控[14]等。目前對植物WD40 蛋白質的研究主要集中于模式植物擬南芥,如Lee 等[15]通過酵母雙雜交實驗分離得到擬南芥WD40 蛋白質AtSeh1,分析其結構發現AtSeh1 含有4 個WD40 基序,為COPⅡ囊泡的重要組成部分,可通過控制動力蛋白AtDRP2A(控制從反面高爾基網絡到中央液泡的蛋白運輸)來調控膜泡運輸；Gachomo等[16]通過反向遺傳和蛋白質建模分離出擬南芥WD40 蛋白質家族成員GIGANTUS1(GTS1),并發現其可通過調控細胞中核糖體的結構、活動和生物遺傳來調節植物的生長發育；Cheng 等[17]研究發現擬南芥GSK3 樣激酶可直接調控MYB-bHLH-WD40 轉錄因子復合體的表達來調控植物體內油菜素內酯的含量進而調控植物根毛區細胞的發育；Beris 等[18]通過RNA 干擾介導基因沉默表達的方法分離出擬南芥WD40 蛋白質AtULCS1,發現其通過與植物泛素環連接酶亞基DDB1α 相互作用導致某種特異酶的降解,來抑制花藥細胞次生壁的形成。

諸多研究學者對其他生物WD40 蛋白質也進行了相關研究,如Ge 等[19]發現煙草NtTTG1 和NtTTG2 可分別與誘導蛋白ParA1、參與生長素信號轉導途徑的3種蛋白質(NtARF8、NtARF17 和NtARF19)共同作用來調控煙草的生長發育及對抵御病原菌的浸入,說明WD40 蛋白質可與多種蛋白質相互作用促進植物的生長發育；Lee 等[20]分離出一種歐洲油菜WD40 蛋白質BnSWD1,發現其在鹽脅迫、脫落酸、茉莉酸甲酯及水楊酸處理下的表達水平較對照顯著升高,推測該基因可能依賴脫落酸或其他信號來響應鹽脅迫,為研究WD40 蛋白質響應非生物脅迫提供一種新思路；Guerriero 等[21]在子囊菌中分離出WD40 蛋白質編碼基因WDR,分析后發現其是真菌幾丁質生物合成基因簇中的保守成員,并參與了細胞壁的形成調控,Beris等[18]在擬南芥中也得出類似結果,說明在植物和真菌中WD40 蛋白質功能具有保守性。

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)為西北干旱半干旱地區特色灌木樹種,其果實中花青素含量豐富,經濟價值較高[22-23]。目前關于黑果枸杞的研究報道主要集中于對其活性成分、代謝途徑、耐鹽性及遺傳轉化研究4 個方面,對黑果枸杞類黃酮及花青素合成途徑關鍵基因的研究尚不常見。本研究通過對黑果枸杞青色期、轉色期和成熟期3 個發育時期的果實進行轉錄組測序,根據測序結果篩選黑果枸杞WD40 蛋白質家族成員,對其進行結構域組成、亞細胞定位、進化關系分析,并對WD40 蛋白質編碼基因成員在果實生長發育3 個時期的表達變化進行分析,以期為黑果枸杞中WD40 蛋白質的功能研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

2016年7月12日在寧夏林業研究院枸杞資源試驗田選取生長健康、長勢良好的黑果枸杞植株(組培苗扦插繁育)并標記,開花后25 d 開始采摘青果期果實,40 d 后采摘轉色期果實,58 d 后采摘成熟期果實(各生育期取樣果實大小、飽滿度一致)。以3 株黑果枸杞的果實為一個重復,設3 次生物學重復,取樣后立即用液氮速凍,-80℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 果實總RNA 提取、文庫構建及轉錄組測序 利用天根生化科技(北京)有限公司提供的植物總RNA 提取試劑盒(RNA Prep Pure Plant Kit)分別提取黑果枸杞青色期(G1 ～G3)、轉色期(C1 ～C3)和成熟期(B1～B3)果實的總RNA,采用NanoDrop-2000 核酸檢測儀(上海Thermo Scientific 有限公司)檢測RNA 純度(OD260/OD280),通過Qubit? 1.0 熒光儀(上海恒斐生物科技有限公司)對RNA 濃度進行精確定量,然后用Agilent 2100 生物分析儀(安捷倫,美國)精確檢測RNA 的完整性,最后以1%的瓊脂糖凝膠電泳。樣品檢測合格后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序,后續分析基于此測序結果數據。

1.2.2 黑果枸杞和擬南芥WD40 蛋白質編碼基因的篩選 基于轉錄組測序數據,在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG 及GO 7 個數據庫進行注釋,初步注釋到136 個WD40 基因,將這些基因編碼的蛋白質逐個進行NCBI Blastp 和SMART 預測,去除重復序列或短序列后,最終得到77 個WD40 基因。擬南芥WD40 蛋白質序列從TAIR(http：/ /www.arabidopsis.org/)數據庫中下載獲得。

1.2.3 黑果枸杞WD40 蛋白質家族結構域、亞細胞定位及進化關系分析 對初步注釋得到的136 個黑果枸杞WD40 蛋白質逐個進行NCBI Blastp 和SMART 預測,得到每個WD40 蛋白質的結構域組成,根據其所含結構域分析其結構特征；利用在線軟件Prot Comp 9.0(http：/ /linux.softberry.com)對77 個候選WD40 基因家族各成員的氨基酸序列進行亞細胞定位預測分析；利用MEGA6.0 軟件對77 個黑果枸杞WD40 蛋白質和部分功能明確的擬南芥WD40 蛋白質(共34 個,包括僅含WD40 基序的WD40 蛋白質13 個,同時包含WD40 基序和其他結構域的WD40 蛋白質21 個)進行序列比對,并用鄰接(Neighbor-Joining)法構建系統進化樹,進行Bootstrap 測試,重復設置為1 000,其他參數為默認設置。

1.2.4 黑果枸杞WD40 基因的表達模式分析 黑果枸杞果實轉錄組測序文庫中各基因片段表達量的計算采用RPKM(reads per kb per million) 法[24]。采 用Heml 軟件對77 個黑果枸杞WD40 基因在果實發育各生育期的表達數據進行分層聚類分析,得到黑果枸杞WD40 基因家族成員隨果實發育的表達模式。

2 結果與分析

2.1 黑果枸杞果實總RNA 提取、文庫構建及轉錄組測序結果分析

由圖1 可知,9 種RNA 樣品(G1、G2、G3、C1、C2、C3、B1、B2 和B3)的28S 和18S 條帶清晰明亮,且28S和18S 條帶的亮度比接近2 ∶1,各條帶均沒有拖尾現象,各RNA 樣品無DNA 和蛋白污染,說明9 個樣品RNA 的質量和完整性較好,可用于后續研究。

轉錄組測序結果表明,共得到194 385 條基因序列,其中有138 322 個基因被注釋到Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG 和GO 功能數據庫中,占基因總數的71.15%,被同時注釋到7 大數據庫的基因序列有18 088 條?；蜻M行KO 注釋后對參與的KEGG 代謝通路進行分類分析,發現這些基因參與的KEGG 代謝通路共分為5 個分支,即細胞過程(cellular process)、 環 境 信 息 處 理(environmental information processing)、 遺 傳 信 息 處 理( genetic information processing)、代謝(metabolism)和有機系統(organismal system)。

2.2 黑果枸杞WD40 蛋白質編碼基因的篩選與蛋白質序列的分類分析

對所得77 條黑果枸杞WD40 蛋白質序列進行批量SMART 預測,根據其所包含的結構域類型將其分為僅含WD40 基序的WD40 蛋白質和同時含有其他結構域的WD40 蛋白質,最終鑒定出僅含WD40 基序的黑果枸杞WD40 蛋白質有38 個,包括含1 個WD40 基序的蛋白質1 個,含2 個WD40 基序的蛋白質有3 個,含3 個WD40 基序的蛋白質2 個,含4 個WD40 基序的蛋白質6 個,含5 個WD40 基序的蛋白質3 個,含6個WD40 基序的蛋白質7 個,含7 個WD40 基序的蛋白質11 個,含8 個WD40 基序的蛋白質2 個,含11 個WD40 基序的蛋白質2 個,含13 個WD40 基序的蛋白質1 個。鑒定出同時含有WD40 基序和其他結構域的WD40 蛋白質共39 個,這些蛋白質共包含25 種結構域類型(圖2)。

2.3 黑果枸杞WD40 蛋白質的亞細胞定位分析

由圖3 可知,共有42 個WD40 蛋白質定位于細胞質中,占鑒定出的WD40 蛋白質總數的54.55%；24 個蛋白質定位于細胞核中,占鑒定出的WD40 蛋白質總數的31.17%；2 個蛋白質定位于細胞膜上,1 個蛋白質定位于細胞壁上,3 個蛋白質定位于線粒體上,5 個蛋白質定位于內質網上。其中,定位于細胞核及細胞質上的WD40 蛋白質占鑒定出的總WD40 蛋白質的85.71%,說明WD40 蛋白質主要位于細胞核及細胞質中。此外,還有11 個WD40 蛋白質分別定位于細胞膜、細胞壁、內質網及線粒體上,說明WD40 蛋白質在黑果枸杞中分布范圍廣,有利于其行使多種功能。

2.4 黑果枸杞與擬南芥WD40 蛋白質家族的比較分析

圖3 黑果枸杞WD40 蛋白質家族的亞細胞定位預測Fig.3 Sub-cellular localization of WD40 protein family in L.ruthenicum Murr.

利用MEGA5.0 軟件構建黑果枸杞和擬南芥WD40 蛋白家族的系統進化樹,根據進化樹(圖4)的拓撲結構對兩個物種的WD40 蛋白進行聚類分析,共分為五個亞家族,第Ⅰ個亞家族包含17 個WD40 蛋白質,其中黑果枸杞WD40 蛋白質Cluster-26021.51455和擬南芥WD40 蛋白質AT2G19430.1 處于同一進化亞枝；第Ⅱ亞家族包含18 個WD40 蛋白質,其中黑果枸杞WD40 蛋白質Cluster-26021.93652 與擬南芥WD40 蛋白質AT1G65580.1 處于同一進化亞枝上；第Ⅲ亞家族包含14 個WD40 蛋白質,其中黑果枸杞WD40 蛋 白 質 Cluster - 26021.10572、 Cluster -26021.24543 和Cluster-26021.71813 分別與擬南芥WD40 蛋白質AT1G61720.1 和AT5G24520.1 位于同一進化亞枝；第Ⅳ亞家族包含26 個WD40 蛋白質,其中黑果枸杞WD40 蛋白質Cluster-26021.77781 與擬南芥WD40 蛋白質AT2G41500.1 位于同一進化亞枝；第Ⅴ亞家族包含38 個WD40 蛋白質,為進化樹中WD40 成員最多的亞家族,其中黑果枸杞WD40 蛋白質Cluster-26021.46098 和Cluster-26021.86872 均與擬南芥AT4G09820.1 位于同一進化亞枝。根據擬南芥數 據 庫(TAIR： http：/ /www.arabidopsis.org/) 中WD40 蛋白質的功能注釋,擬南芥WD40 蛋白質AT1G61720.1、AT5G24520.1 和AT4G09820.1 均參與了類黃酮及花青素的代謝調控,而黑果枸杞WD40 蛋白質Cluster - 26021.105724、Cluster - 26021.24543、Cluster-26021.46098 和Cluster-26021.86872 與其進化關系較近,可能參與了黑果枸杞中花青素的代謝調控。

2.5 黑果枸杞WD40 蛋白質編碼基因在果實不同發育期的表達模式分析

由圖5 可知,隨著果實的發育成熟,黑果枸杞各WD40 蛋白質編碼基因的表達模式存在差異,共有17個WD40 蛋白質編碼基因隨果實的發育成熟表達上調,其中Cluster-2917.0、Cluster-26021.67536、Cluster-11034.0、Cluster-20812.0 和Cluster-24260.0 基因的上調表達較明顯；共有21 個WD40 蛋白質編碼基因在果實發育的青色期到轉色期表達上調,而在果實發育的轉色期到成熟期表達下調；共有13 個WD40 編碼基因隨果實的發育成熟表達下調,其中Cluster-17972.0和Cluster-26021.148900 基因的表達下調較明顯；共有26 個WD40 蛋白質編碼基因的表達在果實發育的青色期到轉色期、轉色期到成熟期均呈先降低后增加的趨勢。

3 討論

由于不同WD40 蛋白質所含WD40 基序數目不同,且部分蛋白質同時含有其他重要結構域,導致WD40 蛋白質結構和功能的多樣化。Ouyang 等[25]對水稻OsWD40 基因進行系統鑒定與共表達分析,根據水稻WD40 蛋白質所含結構域將水稻WD40 蛋白質分為11 類,包括僅含WD40 基序的WD40 蛋白質145個,同時包含LisH 結構域、Utp12、Utp13、Utp15 和Utp21 結構域、WDAD 或COPI 結構域、NLE 結構域、熱激蛋白重復體、BEACH 結構域及BCAS3 結構域及FBOX/U-BOX 結構域的WD40 蛋白質55 個；Mishra等[9]在谷子全基因組中鑒定得到225 個SiWD40 基因,根據谷子WD40 蛋白質所含結構域將谷子WD40蛋白質分為12 類,包括僅含WD40 基序的WD40 蛋白質146 個,同時包含其他結構域的WD40 蛋白質79個。本研究結果表明,黑果枸杞WD40 蛋白質包括僅含WD40 基序的WD40 蛋白質有38 個,同時含其他結構域的WD40 蛋白質39 個,這與前人研究結果一致,說明WD40 蛋白質的結構在物種間具有高度保守性。

大量研究表明,基因表達模式與基因功能密切相關,如An 等[26]通過檢測蘋果WD40 蛋白質編碼基因MdTTG1 在其根、葉、花及果皮中的表達,發現其在蘋果紅色果皮中表達最高,將蘋果的WD40 蛋白質編碼基因MdTTG1 在擬南芥中異位表達,發現其可提高擬南芥花青素的積累；而Zhu 等[27]發現煙草WD40 蛋白質編碼基因NtTTG2 表達沉默后,煙草花中的花青素含量顯著降低。本研究通過對黑果枸杞WD40 蛋白質編碼基因在果實發育青色期、轉色期、成熟期的表達作分層聚類分析發現,黑果枸杞WD40 蛋白質編碼基因Cluster-2917.0 和Cluster-20812.0 的表達隨著果實發育不斷升高,且在成熟期較轉色期分別提高33 倍和10 倍以上,推測這2 個WD40 蛋白質編碼基因可能正向調控黑果枸杞果實的顏色變化及花青素積累；由黑果枸杞與擬南芥WD40 蛋白質共建的進化樹得出,黑果枸杞WD40 蛋白質Cluster-26021.105724、Cluster-26021.24543、Cluster-26021.46098 和Cluster-26021.86872 與擬南芥中參與花青素調控的WD40 蛋白質進化關系接近,同時結合黑果枸杞WD40 基因隨果實發育的表達模式中這些基因的表達趨勢,進一步證實了這些基因可能為花青素合成調控的候選基因。本試驗結果為枸杞中WD40 蛋白質編碼基因的分離和研究提供了一定的理論基礎。

4 結論

本研究基于黑果枸杞不同發育時期果實轉錄組測序結果,篩選注釋出77 個黑果枸杞WD40 蛋白質編碼基因；分析其結構域和結構組成得出黑果枸杞WD40蛋白質家族成員結構保守；亞細胞預測結果顯示,黑果枸杞WD40 蛋白質主要分布于細胞核及細胞質中,其家族成員隨果實發育呈現不同的表達模式。本研究結果為枸杞中WD40 蛋白質編碼基因的研究提供了一定的理論依據。下一步將通過實時熒光定量PCR 對WD40 蛋白質編碼基因的表達進行驗證,并挑選隨果實顏色變化表達差異顯著的WD40 蛋白質編碼基因,并對其功能進行研究。