干旱處理下不同烤煙品系的生理差異研究

趙 莉 周 炎 汪海燕 史宏志 趙世民 常靈康 楊慶敏 楊惠娟,?

(1河南農業大學煙草學院,河南 鄭州 450002；2浙江大學農業與生物技術學院,浙江 杭州 310058；3 河南省煙草公司洛陽分公司,河南 洛陽 471000；4河南省煙草公司洛陽市公司嵩縣分公司,河南 洛陽 471400)

目前,世界上超過三之一的土地處于干旱和半干旱地帶,而生長在非干旱地區的植物,在其不同的生長期也時常遭受不同程度的干旱影響[1-3]。干旱能夠對植物各階段的生長發育和生理代謝過程產生影響,對農作物生長造成的危害處于非生物脅迫的首位。作為脅迫因子,干旱會加速植物細胞老化,甚至死亡[4]；導致膜脂過氧化,過氧化產物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加；使植物體內抗氧化酶系統,超氧化物歧化 酶(superoxide dismutase,SOD)、 過 氧 化 物 酶(peroxidase,POD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的含量和活性發生變化[5-7]。此外,干旱條件下,植物的光合作用會受到影響,葉綠體數量減少,結構遭到破壞[8-10],光合速率降低[11-14]。植物在應對干旱脅迫時,會產生并積累滲透調節物質脯氨酸以維持細胞正常膨壓,提高抗旱能力[15]。

煙草(Nicotiana tabacum L.)是一種起源于降雨量充足的熱帶、亞熱帶地區的喜光喜溫作物,也是重要的經濟作物[16-17]。研究表明,煙草在整個生育期對于水分的要求較高,只有在水分充足的條件下才能正常生長,且品質較高[18]。面對日益嚴重的干旱問題,煙草行業亟待培育抗旱特性好、適應性強的烤煙品種。LY1306 是一個抗旱能力極強的烤煙品系,適合豫西干旱煙區種植。本研究在干旱條件下,通過比較LY1306與對照品種(中煙100、紅花大金元)的生理變化差異,旨在深入了解LY1306 抗旱生理機制,為LY1306 的種植推廣奠定基礎,為培育抗旱烤煙品種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設計

1.1.1 供試材料 LY1306、中煙100 和紅花大金元,分別由河南省煙草公司洛陽市公司嵩縣分公司、中國農業科學院煙草研究所和云南省煙草農業科學研究院提供。

中煙100 是北方煙區主栽品種,具有一定的抗旱能力；研究發現紅花大金元在苗期具有較好的抗旱性[19],因此將這2 個品種作為對照品種。LY1306 是以耐旱、抗病為指標選育出的適應性強、抗性好、易烘烤、產值高、遺傳性狀穩定的株系。

1.1.2 PEG-6000 對供試材料生理變化的影響 試驗于2015-2016年在河南農業大學國家煙草栽培生理生化基地進行。使用聚乙二醇6000(PEG-6000)模擬干旱脅迫,漂浮育苗培育LY1306、中煙100 和紅花大金元46 d,待煙草幼苗長至4 片葉后移栽至珍珠石中,以MS 液體培養基(不含糖、瓊脂)進行培養,每3 d更換1 次新鮮培養液。移栽后23 d,以在培養基中加入PEG-6000,使其終濃度為25%作為處理組[20-21],以不添加PEG-6000 為對照組(CK),每個處理設3 次重復。待處理組的中煙100 和紅花大金元葉片出現萎蔫時(即25% PEG-6000 處理5 h 后),采集對照組及處理組的煙草葉片樣品(統一選取大于5 cm 葉片,從上往下數第4 和第5 片葉),液氮速凍,-80℃保存,用于葉片中SOD、POD 和CAT 活性及MDA 和脯氨酸(proline, Pro)含量的測定。

1.1.3 反復干旱對LY1306 品系及對照品種生理變化的影響 試驗于2015-2016年在河南農業大學國家煙草栽培生理生化基地實施。試驗設2 個處理(表1),即對照組(CK) 和反復干旱處理組(repeated drought stress,RD)。用可拆卸黑筐(上層底部有鏤空,可懸掛放入下層容器,下層為密閉容器)填充適當密度的煙草專用基質,將供試品種(系)種子均勻撒在基質上,出苗初期至十字期用清水培育,十字期后在下層容器施入相同體積的MS 培養液(不含糖、瓊脂)繼續培育。育苗50 d 后,不再向下層容器加入液體,基質充分干燥后(約54 d 后),對照組(CK)加入2.0 L 去離子水,反復干旱(RD)處理組不加水,其基質干燥(約3 d)后重復以上處理1 次。第3 個3 天開始,對照組從上層撒施清水2.0 L,反復干旱處理組從上層撒施清水0.5 L。第4 個3 天開始,對照組從上層撒施清水1.0 L,其從上層撒施清水0.2 L,其基質干燥(約3 d)后重復以上處理,重復3 次。反復干旱處理組基質再次出現干燥后,進行取樣,樣品均為大于5 cm 葉片,用于葉片中SOD、POD 和CAT 活性,MDA 和脯氨酸含量測定,并對葉片取樣固定,進行透射電鏡檢測,觀察葉片細胞葉綠體及內部結構變化。在最后一次撒施清水前測量對照和處理組第4 片葉的凈光合反應速率(net photosynthetic rate, Pn)、 氣 孔 導 度(stomatal conductance,Gs)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration,Ci)和蒸騰速率(transpiration rate,Tr),葉綠素熒光參數,并按照公式計算葉片水分利用率(water use efficiency,WUE)：

1.2 測定項目與方法

1.2.1 SOD 活性測定 利用SOD 微量法試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)進行SOD 活性測定：黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子可還原氮藍四唑生成藍色甲臜,甲臜在560 nm 下有吸收峰。SOD 可清除從而抑制甲臜的形成。使用Thermo Fishe 酶標儀1510(賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific,美國)檢測樣本在560 nm 處吸光值,用于計算SOD 活性[22]。

1.2.2 POD 活性測定 利用POD 微量法試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)進行POD 活性測定：POD催化H2O2氧化特定底物,且在470 nm 處有特征光吸收。按照試劑盒說明書在96 孔板中依次加入試驗試劑和樣本,立即混勻并計時,記錄在470 nm 處30 s 時的吸光值和90 s 后吸光值,用于計算POD 活性[23]。

1.2.3 CAT 活性測定 利用CAT 微量法試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)進行CAT 活性測定：CAT能夠分解H2O2,H2O2在240 nm 處有特征吸收峰,使反應溶液在240 nm 處的吸光度隨著反應時間的延長而逐漸下降,根據吸光度變化率計算CAT 活性。在96孔板中加入樣本和試劑,混勻5 s 或在酶標儀上振動5 s 并立即計時,記錄240 nm 處初始吸光值和1 min后吸光值,用于計算CAT 活性[24]。

1.2.4 MDA 含量測定 利用MDA 微量法試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)進行MDA 含量測定：MDA與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)縮合,生成紅色產物,在532 nm 處有最大吸收峰,使用酶標儀進行比色后可估測樣品中過氧化脂質的含量,同時測定600 nm 處吸光度,利用532 nm 與600 nm 處吸光度差值計算MDA 含量[25]。

1.2.5 脯氨酸含量測定 利用脯氨酸微量法試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)進行含量測定：用磺基水楊酸(sulfonylsalicylic acid,SA)提取,加熱處理后,與酸性茚三酮溶液反應生成紅色,甲苯萃取后,利用酶標儀在520 nm 處測定吸光度,用于計算脯氨酸含量[26]。

1.2.6 透射電鏡檢測 各處理選取大于5 cm 的煙草幼苗葉片,從上往下第4 片葉避開葉脈選擇中間部分切成10 mm2的小塊,抽氣后,置于pH 值7.2 磷酸緩沖溶液配成的5%戊二醛溶液中4℃固定。0.1 mol·L-1pH 值7.0 磷酸緩沖溶液漂洗樣品3 次,每次15 min,浸入1%鋨酸中固定2 h,然后用0.1 mol·L-1pH值7.0 磷酸緩沖溶液漂洗樣品3 次,每次15 min,充分漂洗后用不同濃度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%)和丙酮順次脫水,包埋劑包埋。包埋好的樣品利用LEICA EM UC7 型超薄切片機(LEICA 徠卡,德國),切成70 ～90 nm 切片,切片經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5 ～10 min,利用Hitachi H-7650 型透射電鏡(Hitachi日立,日本)觀察拍片。

1.2.7 光合生理參數的檢測 采用Li-6400 便攜式光合作用測定儀(LI-COR,美國)測定煙草幼苗第4 片有效葉的Pn、Gs、Ci 和Tr、葉綠素熒光參數。測定過程中葉室內光強約為800 μmol·m-2·s-1,大氣溫度36±1℃,大氣CO2濃度400±20 μL·L-1。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2013 軟件進行數據分析；Photoshop CS3 進行圖片處理。

2 結果與分析

2.1 25%PEG-6000 對不同烤煙品種(系)生理變化的影響

2.1.1 25% PEG-6000 對不同烤煙品種(系)形態變化影響 25% PEG-6000 處理模擬了自然界極端干旱的脅迫情況。由圖1 可知,正常生長條件下,LY1306和對照品種(中煙100、紅花大金元)長勢一致,經25%PEG-6000 脅迫處理5 h 后,紅花大金元葉片出現萎蔫,中煙100 個別葉片出現萎蔫癥狀,而LY1306 葉片保持正常,未出現失水萎蔫。

圖1 25%PEG-6000 處理對不同烤煙品種(系)葉片狀態的影響Fig.1 Effect of 25%PEG-6000 stress treatments on leaf status in different flue-cured tobacco varieties

2.1.2 不同處理對不同烤煙品種(系)抗氧化酶活性的影響 由圖2 可知,25% PEG-6000 模擬干旱脅迫下,LY1306 和對照品種的SOD 活性均呈上升趨勢,以LY1306 的SOD 活性為最高,增幅達到445.42%,中煙100 和紅花大金元的SOD 活性增幅分別為64.89%、69.88%。表明LY1306 品系對干旱脅迫可更敏感地作出反應,對干旱環境適應性和抗旱能力更強。

由圖3 可知,25% PEG-6000 脅迫下,LY1306 和紅花大金元的POD 活性均有不同程度的升高,分別提高183.32%、6.39%,而中煙100 的POD 活性則下降了21.07%,其變化趨勢與LY1306 和紅花大金元相反。表明LY1306 品系對干旱脅迫可敏感地作出反應,酶活性升高幅度大,抗旱能力強；紅花大金元對干旱脅迫適應性較差,POD 活性變化不明顯；中煙100因受脅迫較重,損傷膜結構并使酶活性受到抑制。

圖2 25%PEG-6000 對不同烤煙品種(系)SOD 活性的影響Fig.2 Effect of 25%PEG-6000 stress treatments SOD activity in different flue-cured tobacco varieties

圖3 25%PEG-6000 對不同烤煙品種(系)POD 活性的影響Fig.3 Effect of 25%PEG-6000 stress treatments on POD activity in different flue-cured tobacco varieties

由圖4 可知,25%PEG-6000 脅迫下,LY1306 的CAT 活性呈降低趨勢。與CK 相比,LY1306、中煙100和紅花大金元分別降低35.07%、21.93%和43.69%。表明25%PEG-6000 脅迫下,3 種烤煙均無法通過提高CAT 活性來應對干旱脅迫,這可能是因為干旱脅迫破壞了CAT 相關的膜結構,從而抑制了酶活性。

2.1.3 不同處理對不同烤煙品種(系)葉片中MDA含量的影響 MDA 含量是反映植物在遭受脅迫時所受傷害程度的重要指標。由圖5 可知,25%PEG-6000脅迫下,各處理3 個供試品種葉片中的MDA 含量均有所升高, LY1306 的MDA 含量明顯低于中煙100,略高于紅花大金元。表明3 個烤煙品種與CK 相比膜結構都受到了不同程度的破壞,LY1306 的膜結構過氧化水平明顯低于中煙100,略高于紅花大金元,膜結構抗氧化程度中等。

圖4 25%PEG-6000 對不同烤煙品種(系)CAT 活性的影響Fig.4 Effect of 25%PEG-6000 stress treatments on CAT activity in different flue-cured tobacco varieties

圖5 25%PEG-6000 對不同烤煙品種(系)MDA 含量的影響Fig.5 Effect of 25%PEG-6000 stress treatments on the content of malonaldehyde in different flue-cured tobacco varieties

圖6 25%PEG-6000 對不同烤煙品種(系)脯氨酸含量的影響Fig.6 Effect of 25%PEG-6000 stress treatments on the content of proline in different flue-cured tobacco varieties

2.1.4 不同處理對不同烤煙品種(系)脯氨酸含量的影響 由圖6 可知,25%PEG-6000 處理下,LY1306、中煙100 和紅花大金元葉片脯氨酸含量較為接近,但與CK 相比,分別增加198.00%、25.48%和397.83%,其中LY1306 與紅花大金元脯氨酸增加量較高。表明LY1306 在干旱脅迫下,通過脯氨酸調節的滲透調節能力較好,易在脅迫條件下保持較好的生理狀態。

2.2 反復干旱對不同烤煙品種(系)生理變化的影響

2.2.1 反復干旱對不同烤煙品種(系)抗氧化酶活性的影響 由圖7 可知,與CK 相比,反復干旱處理后的LY1306 和紅花大金元SOD 活性均有不同程度的下降,降幅分別為32.43%和9.26%。中煙100 的SOD活性表現出與其他品種相反的變化,其較CK 增加16.40%。表明干旱脅迫下, SOD 活性的變化可能不是LY1306 適應脅迫環境的主要應對機制。

圖7 反復干旱對不同烤煙品種(系)SOD 活性的影響Fig.7 Effect of repeated drought stress treatments on the SOD activity in different flue-cured tobacco varieties

由圖8 可知,在正常培養下,LY1306 和中煙100的POD 活性基本一致,紅花大金元POD 活性最低。反復干旱處理后,LY1306、中煙100 和紅花大金元POD 活性均有不同程度的升高,其中LY1306 品系的POD 活性略高于紅花大金元,中煙100 的POD 活性為最高。表明反復干旱處理后,與中煙100 和紅花大金元相比,LY1306 的POD 活性升高幅度較小,說明其抗旱能力強。

圖8 反復干旱對不同烤煙品種(系)POD 活性的影響Fig.8 Effect of repeated drought stress treatments on the POD activity in different flue-cured tobacco varieties

由圖9 可知,反復干旱脅迫后,LY1306 的CAT 活性升高,而中煙100 的CAT 活性無明顯變化,紅花大金元的CAT 活性降低。LY1306 品系CAT 活性明顯高于2 個對照品種。CAT 活性是反映植物抗旱能力的重要指標之一。表明LY1306 利用CAT 活性調節適應干旱環境的能力較好,抗旱能力較強。

圖9 反復干旱對不同烤煙品種(系)CAT 活性的影響Fig.9 Effect of repeated drought stress treatments on the CAT activity in different flue-cured tobacco varieties

2.2.2 反復干旱處理對不同烤煙品種(系)MDA 含量的影響 由圖10 可知,反復干旱脅迫下,LY1306、中煙100 和紅花大金元的MDA 含量均呈升高趨勢；其中,LY1306 的MDA 含量較低,與中煙100 基本持平,但明顯低于紅花大金元。表明LY1306 在反復干旱脅迫下膜結構受到的損傷較小,抗氧化脅迫能力好。

圖10 反復干旱對不同烤煙品種(系)MDA 含量的影響Fig.10 Effect of repeated drought stress treatments on the content of MDA in different flue-cured tobacco varieties

2.2.3 反復干旱處理對不同烤煙品種(系)脯氨酸含量的影響 脯氨酸是重要的滲透調節物質,其含量隨著干旱脅迫程度的加深而升高,恢復澆水后會有一定程度的回落[27]。由圖11 可知,反復干旱脅迫下,與CK 相比,LY1306、中煙100 和紅花大金元的脯氨酸含量均有所升高,其中紅花大金元的脯氨酸含量最高。表明3 個烤煙品系均受到干旱脅迫影響使其脯氨酸含量升高,但由于相同控水條件下,不同品種受到的脅迫程度不同,復水后脯氨酸回落程度也存在差異；其中LY1306 品系受到脅迫程度較輕,抗旱能力強。

圖11 反復干旱對不同烤煙品種(系)脯氨酸含量的影響Fig.11 Effect of repeated drought stress treatments on the content of proline in different flue-cured tobacco varieties

2.2.4 反復干旱處理對不同烤煙品種(系)光合效率的影響 反復干旱會導致光合速率降低。由表2 可知,LY1306 的光合速率和蒸騰速率變化幅度均低于對照品種,說明LY1306 能夠在反復干旱條件下保持較好的光合速率和較低的蒸騰速率,而其他2 個品種的蒸騰速率均較高,不利于水分保持,從而降低了其抗旱能力。

表2 反復干旱對不同烤煙品種(系)光合效率的影響Table 2 Effect of repeated drought stress treatments on the photosynthetic efficiency in different flue-cured tobacco varieties

2.2.5 反復干旱處理對不同烤煙品種(系)細胞結構變化 由圖12、圖13 可知,反復干旱后,LY1306 能夠較好地保持細胞中葉綠素數量及葉綠體形態正常,并保證正常的生理活動。正常情況下,LY1306 與對照品種的葉綠體含量基本一致,葉綠體數量較多,葉綠體形態正常,類囊體片層結構明顯。反復干旱處理后,LY1306 和對照品種的葉綠體數量均有所減少,其中紅花大金元葉綠體數量下降最明顯；LY1306 與中煙100的葉綠體形態也較為完整,類囊體結構較明顯,而紅花大金元葉綠體數量急劇下降,且部分葉綠體變形,類囊體片層結構模糊,表明干旱對其葉綠體結構產生了破壞性作用。結合前人研究[28-31],認為LY1306 在反復干旱下受到的脅迫較小,抗旱能力較強。

3 討論

3.1 LY1306 在干旱脅迫下具有較強清除活性氧的能力

姜慧芳等[32]研究表明,干旱脅迫下,抗旱性強的植物品種酶活性較高,能有效清除活性氧,阻止膜脂過氧化。魏煒等[33]研究發現輕微干旱或短時間脅迫下,SOD、POD、CAT 活性呈上升趨勢,而在重度干旱或長期干旱脅迫下,酶活性呈下降趨勢,且不同品種間的酶活性變化存在差異,抗旱性強的品種能夠保持較高的酶活性,且上升幅度大于抗旱性差的品種。王空軍等[34]研究發現,干旱條件下,保持較高的酶活性能夠有效地清除細胞內累積的活性氧,抑制細胞膜過氧化,減少MDA 的產生,進而提高植物的抗旱能力。本研究中,25%PEG-6000 干旱脅迫下,LY1306 葉片基本能夠保持正常狀態,而對照品種則表現出葉片萎蔫,這與前人[35]研究結果基本一致。25% PEG-6000 干旱脅迫下,LY1306 的SOD 活性顯著高于對照品種,具有較好的清除氧自由基的能力,可以及時清除過量的活性氧以緩解逆境下氧化脅迫對植物細胞造成的傷害[36]。與對照品種相比,LY1306 的SOD、POD 活性升高幅度均為最大,而CAT 活性降低幅度較小。LY1306 活性氧代謝產物MDA 在葉片中的積累量明顯低于中煙100,但略高于紅花大金元。反復干旱脅迫下,LY1306保持較高的CAT 活性,將MDA 含量維持在較低水平,使細胞膜系統受損傷較低,能夠在脅迫下抵御惡劣的外界環境。電鏡結果表明,反復干旱后,LY1306 能夠較好地保持細胞中葉綠素數量和葉綠體形態正常,類囊體片層結構較為明顯；LY1306 光合速率下降幅度較小,表明LY1306 具有較好的清除活性氧的能力,能夠更好地維持正常生理代謝。

圖12 反復干旱脅迫下供試品種細胞結構比較(×2 μm)Fig.12 Comparison of cell structure between tested varieties under repeated drought stress treatments(×2 μm)

圖13 反復干旱脅迫下供試品種葉綠體結構比較(×1 μm)Fig.13 Comparison of chloroplast structure between LY1306 and control varieties under repeated drought stress treatments (×1 μm)

3.2 LY1306 在干旱脅迫下具有較強脯氨酸滲透能力

脯氨酸作為重要的滲透調節物質,干旱條件下該物質含量的增加可以增強植物的抗性,以緩解植物受脅迫傷害的程度[37]。研究發現在經受干旱環境時,植物組織中會積累較多有利于自身調節的物質,以起到自我保護的作用,參與植物組織的滲透調節,這些物質在作物的抗旱研究中具有重要作用。Cohen 等[38]通過對不同品種的小麥進行研究,發現小麥的滲透調節能力與小麥干物質積累量、產量以及抗旱性呈正相關。朱維琴等[39]和王賀正等[40]的研究表明,作物處于干旱脅迫環境下,葉片中的脯氨酸、游離氨基酸、可溶性糖和可溶性蛋白質等有機物含量與正常情況相比均顯著增高,且對同一作物的不同品種而言,增高幅度存在顯著性差異,普遍表現為品種抗旱性越強,增幅越大。本研究也發現了類似的現象,3 個烤煙品種的脯氨酸積累量均有所升高,其中LY1306 積累的脯氨酸含量最高,表明其具有較好的滲透調節能力和較強的抗旱能力；反復干旱處理下,LY1306 可能通過其他滲透調節物質維持細胞正常的生理活動及形態,而脯氨酸滲透調節僅起到輔助作用。

4 結論

本研究結果表明,干旱脅迫條件下,烤煙品系LY1306 能夠通過自身生理變化,維持較好的生理形態,且具有較好的活性氧清除能力和滲透調節能力,使細胞能夠保持較好的生理代謝。綜上,LY1306 具有較好的抗旱能力。本研究為抗旱烤煙品系LY1306 的進一步推廣奠定了基礎,也為培育抗旱烤煙品種提供了理論依據。