苯并芘(BaP)對鯉魚肝、腎抗氧化、非特異性免疫能力及組織結構的影響

陳劍杰 曹謹玲 賀鑫晉 郭文靜 羅永巨 高榮琨

(1山西農業大學動物科技學院/山西省生態畜牧與環境獸醫學重點實驗室, 山西 太谷 030801；2 廣西水產研究所,廣西 南寧 530021)

多環芳烴(polycyclicaromatic hydrocarbons,PAHs)是一類種類多、分布范圍廣的有機污染物,因其特定的理化性質使其可以直接或間接危害生物,是能加劇環境污染的物質。苯并芘(BaP)作為PAHs 的代表,廣泛分布于自然界的大氣、土壤和水體中,一方面損害生物圈、破壞生態平衡、威脅生物多樣性；另一方面嚴重威脅著人類和各種生物的生存、進化、繁衍及生存環境。朱利中等[1]檢測杭州市地表水中多環芳烴污染情況,發現苯并芘平均濃度最高達1.582 mg·L-1；田蘊等[2]于2001年調查廈門西港表層海水中多環芳烴的分布情況,發現苯并芘含量為0.6 ～23.4 ng·L-1；周芳等[3]研究表明,太湖梅梁灣水中苯并芘平均濃度為0.3～0.4 mg·L-1。苯并芘特有的理化性質、廣泛的毒性作用,使其存在于水體、沉積物或水生生物體內會對水中生物產生較為嚴重的負面影響[4-5],Carlson 等[6]研究發現苯并芘對日本青鳉有一定的免疫毒性,會降低其機體對細菌感染的抵抗能力；王云等[7]等研究表明,苯并(α)芘能對褐菖肝臟造成抗氧化損傷,使其DNA 鏈斷裂,且存在劑量效應關系；Hoffmann 等[8]研究發現苯并芘作用于斑馬魚后會對其產生一定的生殖毒性。目前,關于苯并芘對魚類的毒性作用研究[9-11]已有大量報道,而苯并芘對魚類肝、腎抗氧化系統、非特異性免疫和組織結構的毒性作用尚鮮見報道。因此,本研究以我國淡水鯉魚作為受試生物,研究苯并芘對魚類肝、腎抗氧化系統、非特異性免疫和組織結構的毒性作用,以期為進一步探究苯并芘對魚類的毒性效應機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

健康鯉魚300 尾,平均體重為18±0.86 g,由清徐漁場提供,經5%食鹽水消毒后,在實驗室內暫養7 d,選擇大小均勻、體表無傷的個體進行試驗。

1.2 主要儀器與試劑

苯并芘(BaP) 購自美國AccuStandard 公司；助溶劑為二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),購自美國Amresco 公司；溶壁微球藻凍干粉購自美國Sigma 公司；L-dopa(levodopa)購自美國Sigma 公司；考馬斯亮藍(coomassie dimethyl sulfoxide brilliant blue G-250)、酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、 超 氧 化 物 歧 化 酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、 谷 胱 甘 肽 ( glutathione, GSH)、 丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。BX53 顯微鏡成像系統(日本奧林巴斯)；AUY-120 型電子分析天平(日本島津公司)；UV2100 紫外可見分光光度計(上海尤尼柯公司)；MK3 酶標儀(美國Thermo 公司)；TGL-10B 高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；XZ-0142 水質分析儀(上海希慶電子科技有限公司)。

1.3 試驗方法

將鯉魚隨機分為5 組,包括對照組：0 μg·L-1BaP(CK1)、0.001% DMSO(CK2)和處理組：0.1(T1)、0.5(T2)、1.0(T3)μg·L-1BaP(助溶劑DMSO 終濃度為0.001%)。每組設3 個平行,每個平行包括鯉魚15尾,試驗期間每5 d 徹底清潔水族箱1 次,持續30 d,試驗期間持續充氧,試驗所用水符合漁業水質標準GB/T 11607-1989[12]。

1.4 樣品采集及指標測定

1.4.1 NBT 陽性細胞數的測定 每組隨機取3 尾魚(每個平行1 尾),清水沖洗體表,擦干后用注射器尾靜脈采血于抗凝管中備用。按照參考文獻[13]的方法測定NBT 陽性細胞數：取50 μL 血細胞滴在蓋玻片上,室溫下于濕盒內溫育30 min,然后用pH 值6.4 0.067 mol·L-1磷酸緩沖液(phosphatic buffer solution,PBS)輕輕地洗滌蓋玻片以完全去除紅細胞,隨后滴加0.2 g·L-1硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)50 μL,將蓋玻片反扣于載玻片上,濕盒內溫育30 min,于顯微鏡下隨機6 個視野進行觀察計數,淺黑色細胞即為NBT 陽性細胞。

1.4.2 酶活性的測定 各試驗組分別隨機取鯉魚15尾(每個平行5 尾)擦干,于冰塊上解剖分離肝和腎臟,用4℃的生理鹽水漂洗后拭干水分,以1 ∶10(質量體積比)加入4℃生理鹽水勻漿,3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,4℃保存備用。SOD 活性采用黃嘌呤氧化酶法測定[14]；CAT 活性采用鉬酸銨法測定[14]；GSH 含量采用DTNB 比色法測定[15]；MDA 含量采用TBA 法測定[16]；ACP、AKP 活性采用磷酸苯二鈉法測定[14]；溶菌酶(lysozyme, LZM)活性參考劉睿智等[17]的方法,以溶壁微球藻菌凍干粉為底物進行測定；酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性參照考文獻[18]的方法,以L-dopa 為底物進行測定；蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定。上述指標均在當天完成測定。

1.4.3 肝、腎組織切片的制備 試驗30 d 后,各試驗組分別隨機取試驗魚2 尾,擦干表面后解剖分離肝、腎組織。組織切片制備按照參考文獻[15]的方法進行：組織用Bouin’s 液(波恩氏液)固定24 h 后,70%酒精沖洗,梯度酒精(75%、85%、95%、100%)脫水,二甲苯透明,組織浸蠟后用溶解好的石蠟進行組織包埋,石蠟切片機切片厚度約6 μm,經HE(蘇木精-伊紅)染色中性膠封片后利用顯微鏡成像系統觀察并拍照。

1.5 數據分析

采用SPSS 16.0 進行單因素方差分析和LSD 法多重比較,顯著性水平為P＜0.05,相關性分析采用雙變量相關分析。所有數據均以平均值±標準差表示。

圖1 BaP 暴露對鯉魚NBT 陽性細胞的影響(n=6)Fig.1 Effect of BaP exposure on NBT positive cells in carp(n=6)

2 結果與分析

2.1 BaP 暴露對鯉魚NBT 陽性細胞的影響

由圖1 可知,與CK1 相比,CK2 的NBT 陽性細胞數無顯著性差異,處理組(T1、T2、T3)NBT 陽性細胞數均顯著下降(P ＜0.05),分別較CK1 下降13.53%、18.82%、33.53%。相關性分析表明,暴露30 d 后,BaP 暴露濃度與鯉魚NBT 陽性細胞數呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.781,P＜0.05)。

2.2 BaP 暴露對鯉魚肝、腎抗氧化能力的影響

由圖2 可知,BaP 暴露30 d 后,與CK1 相比,對CK2 的肝、腎抗氧化能力的影響無顯著性差異,但對處理組(T1、T2、T3)肝、腎抗氧化能力產生一定影響。CK1 相比,T1、T2、T3 肝、腎組織中的SOD、CAT、GSH活性均呈先上升后下降的趨勢,而MDA 含量則呈先下降后上升的趨勢。T1、T2 肝組織的SOD 活性與CK1 相比分別提高10.24%和3.12%,且T1 顯著高于CK1,T3 肝組織SOD 活性與CK1 相比顯著下降9.91%。T1 肝組織的CAT 活性較CK1 顯著提高15.55%,而T2、T3 肝組織的CAT 活性較CK1 分別下降5.61%和16.67%,且T3 顯著低于CK1。與CK1 相比,T1、T2 肝組織的GSH 活性分別升高2.06%和2.29%,T3 肝組織的GSH 活性下降1.02%,但各處理組肝線織GSH 活性與CK1 均無顯著性差異。與CK1相比,T1 肝組織MDA 含量下降0.49%,T2、T3 肝組織MDA 分別分別上升1.21%、6.19%,且T3 顯著高于CK1。腎組織SOD 活性T1、T2 與CK1 相比分別升高8.81%和6.54%,且T1 顯著高于CK1,T3 腎組織SOD活性較CK1 顯著下降8.61%。處理組(T1、T2、T3)腎組織的CAT 活性較CK1 分別升高8.37%、14.28%和6.08%,且T2 顯著高于CK1。與CK1 相比,T1、T2 腎組織的GSH 活性分別升高4.98%和8.22%,而T3 腎組織的GSH 活性顯著下降15.49%。與CK1 相比,T1腎組織的MDA 含量下降0.96%,而T2、T3 腎組織的MDA 含量分別上升1.24%、20.07%,且T2、T3 均顯著高于CK1。

圖2 不同BaP 濃度暴露對鯉魚肝、腎抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of BaP exposure on capability of anti-oxidative in the liver and kidney of the carp

2.3 BaP 暴露對鯉魚肝、腎非特異性免疫能力的影響

由圖3 可知,試驗30 d 后,與CK1 相比,CK2 肝、腎特異性免疫能力無顯著性差異,而處理組(T1、T2、T3)鯉魚肝、腎的特異性免疫能力均受到一定的影響。與CK1 相比,處理組肝組織的AKP、ACP、LZM 和PO活性總體均呈先上升后下降的趨勢。其中T1 肝組織的AKP 活性較CK1 上升3.23%,T2、T3 肝組織AKP活性較CK1 分別下降3.96%和9.01%,且T3 肝組織的AKP 活性顯著低于CK1。與CK1 相比,T1 肝組織的ACP 活性上升1.89%,而T2、T3 肝組織的ACP 活性分別下降2.64%、7.53%,且T3 肝組織的ACP 活性顯著低于CK1。與CK1 相比,T1、T2 肝組織的LZM 活性分別上升3.49%、1.98%,而T3 肝組織的LZM 活性顯著下降4.66%。與CK1 相比,T1、T2 肝組織的PO活性分別上升5.29%、0.18%,而T3 肝組織的PO 活性顯著下降8.61%。與CK1 相比,T1 腎組織的AKP活性升高1.76%,而T2、T3 腎組織的AKP 活性分別下降2.30%、5.58%,且均顯著低于CK1。與CK1 相比,T1、T2 腎組織的ACP 活性分別升高6.21%、2.07%,而T3 腎組織ACP 活性顯著下降7.53%。與CK1 相比,T1 腎組織LZM 活性升高1.27%,T2、T3 腎組織LZM 活性分別下降0.98%、4.65%,且T3 顯著低于CK1。T1、T2 腎 組 織PO 活 性 較CK1 分 別 升 高2.58%、1.41%,而T3 腎組織PO 活性顯著下降6.91%。

圖3 BaP 暴露對鯉魚肝、腎非特異性免疫能力的影響Fig.3 Effect of BaP exposure on capability of non-specific immunity in the liver and kidney of the carp

2.4 BaP 暴露濃度與鯉魚肝、腎抗氧化及非特異性免疫力的相關性分析

相關性分析表明,暴露30 d 后,BaP 暴露濃度與肝SOD、CAT 活性呈負相關(皮爾遜相關系數分別為-0.602、-0.673,P＜0.01),與MDA 含量呈正相關(皮爾遜相關系數為0.638,P＜0.01)。BaP 暴露濃度與腎組織SOD、GSH 活性呈負相關(皮爾遜相關系數分別為-0.531、-0.481,P＜0.05),與MDA 含量呈正相關(皮爾遜相關系數為0.804,P＜0.01)。BaP 暴露濃度與肝AKP、ACP、PO 活性呈負相關(皮爾遜相關系數分別為-0.735、-0.596、-0.665,P＜0.01),與LZM 活性呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.537,P ＜0.05)。BaP 暴露濃度與腎組織AKP、ACP、PO 活性呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.590、-0.461、-0.523,P ＜0.05),與LZM 活性呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.607,P＜0.01)。

2.5 BaP 暴露對鯉魚肝組織結構的影響

由圖4 可知,CK1 肝細胞以中央靜脈為中心,呈放射狀排列,細胞呈近圓形,形狀較規則,界線清晰,核多位于細胞中央。CK2 的肝細胞形態正常,排列比較規則,界限清楚,核清晰可見。T1 肝細胞排列紊亂,可見肝細胞空泡變性,部分細胞界限模糊,少數細胞出現萎縮,T2 肝組織結構輕度紊亂,肝細胞空泡變性,細胞界限模糊,T3 肝細胞排列紊亂,細胞界限模糊,肝細胞空泡變性,部分細胞萎縮。

2.6 BaP 暴露對鯉魚腎組織結構的影響

由圖5 可知,CK1、CK2 均表現為腎組織結構完整,腎小管細胞結構清晰,界限明顯。T1 腎組織結構輕度紊亂,腎小管管腔輕微狹窄,T2 腎組織結構紊亂,腎小管管腔狹窄,T3 腎組織結構紊亂程度加重,可見腎小管萎縮。

圖4 BaP 暴露對鯉魚肝組織結構的影響Fig.4 Effect of BaP exposure on liver structure of carp

圖5 BaP 暴露對鯉魚腎組織結構的影響Fig.5 Effect of BaP exposure on kidney structure of carp

3 討論

正常情況下,生物體具有生成自由基和消除自由基的動態平衡能力。受到外源污染物脅迫時,生物體內的這種平衡可能被打破,導致體內自由基增多,進而引起損傷。此時生物體內的抗氧化系統會起到防御作用,其中SOD 可以使超氧化物陰離子(O2-)轉化為H2O2和O2；CAT 能很快分解H2O2使其轉變為H2O和O2；GSH 能夠使H2O2還原為H2O,而其自身被氧化為氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG),GSSG在谷胱甘肽還原酶的作用下,被還原成GSH,以維持清除體內自由基的過程。MDA 是由自由基引起的脂質過氧化作用生成的分解物質,其含量可以反映機體細胞受自由基危害的情況[14,19-23]。本研究中,與CK1相比,不同濃度BaP 作用于鯉魚30 d 后,鯉魚的抗氧化酶活性和MDA 含量均呈現不同程度的變化,肝、腎組織中SOD、CAT、GSH 活性均呈先上升后下降趨勢,而MDA 含量呈先下降后升高趨勢,這與黃周英等[24]和曹謹玲等[25]的研究結果相似。這可能是由于低濃度BaP 暴露使鯉魚體內自由基的生成與消除失衡,刺激了機體抗氧化防御系統,促使其抗氧化能力代償性增強去消除體內產生的過量自由基,但隨著BaP 濃度繼續升高后,體內自由基也持續積累,細胞損傷加重,使鯉魚抗氧化系統的清除功能趨于飽和,進而表現出SOD、CAT、GSH 活性降低、MDA 含量上升。

在魚類健康養殖領域,關于水體中污染物對魚類免疫系統影響的研究是非常重要的。雖然魚類屬于低等脊椎動物,但已擁有免疫的基本特性。非特異性免疫在魚類的免疫系統中發揮著重要的作用,其中魚類血液中的NBT 陽性細胞起著非常關鍵的作用,其吞噬能力的高低可以反映魚類非特異性免疫能力的強弱,因此,對于NBT 陽性細胞的檢測可以反映機體的非特異性細胞免疫狀態[14,26]。研究表明,水體中污染物可以引起魚類NBT 陽性細胞的下降[13]。本研究也發現,與對照組相比,處理組(T1、T2、T3)的NBT 陽性細胞均表現出顯著下降趨勢,且呈現劑量效應關系,說明BaP 暴露能夠使鯉魚的非特異性細胞免疫能力下降。LZM 能水解革蘭氏陽性細菌細胞壁的粘肽乙酰氨基多糖,并使之裂解釋放,破壞和消除侵入機體的異物,因此LZM 是生物體極為重要的非特異性免疫因子,其活力也是衡量機體免疫狀態的指標之一[27]。PO 作為生物體液免疫的重要因子廣泛分布于動物體內,可以通過包裹和黑化而限制外源物引起的損傷,從而達到提高防御能力的作用[14,18]。劉睿智等[17-18]研究發現BaP 對褐菖鮋腎臟、脾臟的LZM 和PO 活性均有一定影響,且隨著BaP 濃度的增加,LZM 和PO 活性均呈先上升后下降趨勢,這與本研究結果基本一致。這可能是由于BaP 為低濃度時,魚體產生較強的應激反應,在免疫系統調節下溶菌酶和酚氧化酶水平升高,而BaP 為高濃度時,魚體的免疫機能逐漸耗竭,酶水平降低。ACP、AKP 屬于磷酸單酯酶,是廣泛分布在機體內的重要代謝調控酶。ACP 和AKP 作為動物溶酶體酶的重要組成部分, 在免疫反應中發揮著重要作用,對動物生存具有重要意義[14,28-30]。本研究中,與對照組相比,鯉魚肝、腎組織ACP、AKP 活性在BaP 低濃度暴露情況下呈升高趨勢,這可能是由于在BaP 低濃度暴露時鯉魚肝、腎組織中的抗應激水平得以提升,同時免疫能力增強,而高濃度BaP 作用時造成的組織細胞損傷大于其免疫能力,從而導致ACP、AKP 活性受到抑制。研究發現BaP 作用于生物體后會產生損傷作用。馮濤等[31]研究表明,BaP 可以造成大彈涂魚肝細胞內多種細胞器的損傷；翁朝紅等[32]也發現BaP 作用于黑鯛后,會導致其肝、脾、腸組織結構受到不同程度的損害,且隨著BaP 暴露時間的延長而加重。本研究結果也表明BaP 暴露能造成鯉魚肝、腎組織結構不同程度的損害,且損害程度隨著BaP 濃度的升高而加重,這可能是由于BaP 作用于機體后,在代謝過程中產生的中間產物會引發機體氧化應激反應,進而對機體產生毒性作用,且隨著暴露濃度的增加,當毒性作用超過機體抵抗力的時候可能會使機體造成的損傷進一步加重[33-35]。

綜上所述,水體中的一定濃度的BaP 對鯉魚肝、腎組織抗氧化酶(SOD、CAT、GSH)活性、MDA 含量、免疫相關酶(ACP、AKP、LZM、PO)活性和NBT 陽性細胞數量及肝、腎組織結構均有不同程度的影響,但其作用機制還有待進一步研究。

4 結論

本研究表明,水體中BaP 對鯉魚肝、腎組織抗氧化能力、非特異性免疫能力和NBT 陽性細胞以及組織結構均有不同程度的影響,且BaP 對這些影響存在一定的劑量效應關系。