川椒方中揮發油的提取及包合物制備與表征

劉亞梅 杜茂波 沈碩 曹晶 劉淑芝

摘要：目的 ?優選川椒方中蛇床子、荊芥、川芎、花椒混合揮發油的最佳提取工藝，制備混合揮發油與β-環糊精（β-CD）的包合物并表征其形成。方法 ?以收油率為指標，采用單因素試驗優選揮發油提取工藝;以包封率為指標，采用飽和水溶液法制備包合物，通過單因素試驗和正交試驗優選包合工藝參數;采用顯微鏡法和紅外分光光度法對包合物進行表征評價。結果 ?揮發油提取工藝為：加8倍量水，浸泡2 h，提取5 h;包合工藝為：β-CD（g）與水（mL）的比例為1∶10，揮發油（mL）與β-CD（g）的比例為1∶10，在40 ℃條件下包合1.5 h。結論 ?本研究優化篩選的提取包合工藝穩定可行，可用于川椒方的顆粒劑生產。

關鍵詞：川椒方;揮發油;β-環糊精;提取工藝;包合工藝

中圖分類號：R284.2 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0089-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.019

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Abstract： Objective To optimize the extraction process of mixed volatile oil of Cnidii Fructus， Schizonepetae Herba， Chuanxiong Rhizoma， Zanthoxyli Pericarpium of Chuanjiao Decoction; To prepare and identify the compound essential oil / β-cyclodextrin inclusion complex. Methods The extraction process of volatile oil was optimized by single factor experiment with the receiving rate as the index. The inclusion complex was prepared by the saturated aqueous solution method with the encapsulation efficiency as the index， and the inclusion process parameters were optimized by single factor test and orthogonal test. The inclusion complexes were characterized by microscopy and infrared spectrophotometry. Results The optimized extraction conditions were adding 8 fold water， soaking for 2 h， and extracting for 5 h. The optimized inclusion conditions were the β-cyclodextrin to water for 1：10 （g/mL）， volatile oil and β-cyclodextrin at ratio of 1：10 （mL/g）， inclusion temperature 40 ℃ for 1.5 h. Conclusion The optimal extraction and inclusion process are stable and feasible， which can be used for the granule production of Chuanjiao Decoction.

Keywords： Chuanjiao Decoction; volatile oil; β-cyclodextrin; extraction technology; inclusion technology

川椒方是中國中醫科學院眼科醫院治療過敏性結膜炎的臨床經驗方，由花椒、蛇床子、川芎、荊芥等組成，具有疏風清熱止癢功效。方中蛇床子具有燥濕祛風、殺蟲止癢、溫腎壯陽功效^[1]，主要藥效成分為香豆素類和揮發油，藥理研究顯示，揮發油是其發揮止癢作用的有效組分之一^[2]。荊芥功在祛風解表、宣毒透疹，揮發油為其主要藥效成分，具有抗炎、抗過敏作用^[3]。川芎有活血行氣、祛風止痛功效，主要藥效成分為揮發油、川芎嗪、阿魏酸，揮發油所含成分多為藁本內酯類，具有鎮靜、鎮痛、解熱的作用^[4-5]?；ń返闹饕钚晕镔|是揮發油類成分，具有鎮痛、平喘、抗菌、抗炎等功效^[6-7]。由于揮發油易揮發、光熱不穩定，為保證其制劑穩定性并最大限度發揮藥效，本試驗采用水蒸氣蒸餾法提取混合揮發油后用β-環糊精（β-CD）對其進行包合，并采用顯微鑒定、紅外光譜法對包合物進行表征。

1? 儀器與試藥

ZDHW電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司），SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司），DK99-IIA電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠），DGG-9620A型智能鼓風干燥箱（杭州卓馳儀器有限公司），JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），BSA224S-CW型分析天平（德國賽多利斯公司），RW-11B型攪拌器（德國IKA公司），Nikon Eclipse E200MV-R型顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司），FTIR Spectrometer型傅里葉變換紅外光譜儀（Perkins Elmer公司）。

蛇床子（產地河北，批號160716）、川芎（產地四川，批號161016）、荊芥（產地河北，批號160916）、花椒（產地四川，批號161116、170516），購自北京燕北飲片廠，經中國中醫科學院中藥研究所李曼玲研究員檢驗，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》標準;無水硫酸鈉（分析純，批號20140915，國藥集團化學試劑有限公司），無水乙醇（分析純，批號150901，四川金山制藥有限公司），β-CD（批號20170406，郁南縣永光環狀糊精有限公司生產，北京鳳禮精求醫藥股份有限公司提供），純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2? 方法與結果

2.1? 揮發油提取工藝研究

按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）2204項下揮發油測定法甲法測定揮發油，以收油率為指標，采用單因素試驗，對吸水率、加水量、浸泡時間、提取時間進行考察。

2.1.1? 吸水量考察

按處方比例稱取藥物飲片66 g，3份，加10倍量水，浸泡至透心，濾除藥液，測定飲片濕重。吸水倍數=（飲片濕重-飲片干重）÷飲片干重。取3次平均值，結果吸水量為2.45倍，見表1。

2.1.2? 浸泡時間考察

稱取藥物飲片66 g，3份，加7倍量水，分別浸泡0、2、4 h，提取8 h，計算收油率，結果見表2。浸泡時間選擇2 h。

2.1.3? 加水量考察

稱取藥物飲片66 g，2份，分別加7、8倍量水，浸泡2 h，提取7 h，計算收油率，結果出油量分別為0.70、0.80 mL，收油率分別為1.05%、1.17%。故選擇加8倍量水。

2.1.4? 提取時間考察

稱取藥物飲片66 g，加水8倍量，浸泡2 h，記錄不同時間累積出油量，并計算累積收油率，結果見表3。5 h以后出油量不再變化，故選擇提取5 h。

2.1.5? 提取工藝驗證試驗

為保證所篩選提油工藝穩定可行，進行3批驗證試驗。稱取藥物飲片210 g，3份，按優選出的最佳提取工藝（加8倍量水，浸泡2 h，提取5 h）提取揮發油，結果收油率分別為1.09%、1.09%、1.04%，均值為1.07%，RSD=2.69%，表明所選工藝穩定，具有一定重復性和可操作性。

2.2? 揮發油包合工藝研究

目前常用的包合物制備方法有飽和水溶液法、超聲法、膠體磨法等^[8]，其中飽和水溶液法操作簡單、對設備要求低，在實驗室制備和工業化生產中均有廣泛應用。本試驗采用飽和水溶液法制備包合物。影響飽和水溶液法包合率的主要因素為水與β-CD的比例、揮發油與β-CD的比例、包合時間、包合溫度^[9-10]。本試驗以包合率為考察指標，采用單因素試驗篩選加水量，采用正交試驗進一步優化包合工藝參數。

2.2.1? 包合物制備方法

稱取適量β-CD，置200 mL燒杯中，加入一定量蒸餾水，于水浴鍋上沸水浴溶解，晾至所需溫度，攪拌器攪拌下緩緩加入揮發油醇溶液（1∶1）2 mL，恒溫包合至規定時間，包合物溶液置4 ℃冰箱冷藏過夜，取出，抽濾，用適量高純水和少量無水乙醇多次洗滌包合物，置室溫下晾干。

2.2.2? 空白回收率測定

精密量取3份經無水硫酸鈉脫水的揮發油1 mL，置500 mL圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，玻璃珠數個，按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）2204項下揮發油測定法甲法測定，得揮發油的回收量分別為0.89、0.90、0.91 mL，計算平均值，結果空白回收率為90%。

2.2.3? 包封率測定

精密稱定所得包合物干燥粉末，置500 mL圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，玻璃珠數個，按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）2204項下揮發油測定法甲法測定，計算包封率。包封率（%）=包合物中揮發油量（mL）÷[揮發油加入量（mL）×空白回收率（%）]。

2.2.4? 加水量篩選

以包封率為指標，采用單因素法篩選加水量。精密量取揮發油1 mL，3份，分別加入β-CD 10 g，為保證水溶液飽和，設置相當于β-CD 8、10、12倍的加水量，按“2.2.1”項下方法包合2 h，測得其包封率分別為64.44%、71.11%、53.33%，故加水量選擇10倍。

2.2.5? 正交試驗優選包合工藝

以揮發油與β-CD的比例、包合溫度、包合時間為考察因素，每個因素3個水平，因素水平見表4。以包封率為考察指標，采用L₉（3⁴）正交表安排試驗，按“2.2.1”項下方法制備包合物，測定包封率，正交試驗結果見表5。采用SPSS17.0軟件進行方差分析，結果見表6。

由直觀分析可知，影響揮發油包封率的主次順序為B>A>C，即包合溫度>揮發油與β-CD比例>包合時間，其中包合溫度為主要影響因素;方差分析顯示，A、B、C三因素對包合工藝均無顯著差異，為節約生產成本，確定最佳工藝為A₂B₁C₂，即β-CD與揮發油比例為10∶1，包合溫度40 ℃，包合時間1.5 h。

2.2.6? 干燥方法篩選

包合物干燥方法有冷凍干燥、噴霧干燥、自然干燥、鼓風干燥等^[11]。冷凍干燥適用于在干燥過程中易分解變色的藥物，所制備包合物易溶于水，多用于制備粉針劑;噴霧干燥既可用于包合物干燥，又可用于包合物的制備，適用于難溶性藥物，但損失大，包合物收率低^[8];鼓風干燥設備要求低，操作簡單，適合工業化生產。本研究選用鼓風干燥法（40 ℃）和自然晾干法，以包封率為考察指標，采用單因素試驗篩選最佳干燥方法。精密量取揮發油1 mL，2份，按最佳包合工藝制備包合物水溶液，抽濾，濾餅分別置于不同條件下干燥，測得包封率為86.67%。為節省工時，選擇40 ℃鼓風干燥。

2.2.7? 包合工藝驗證試驗

精密量取揮發油1 mL，3份，按最佳包合工藝制備揮發油包合物，測定包封率，結果包封率分別為88.89%、88.89%、86.67%，平均包封率為88.15%，RSD=1.45%，表明此包合工藝穩定可行。

2.3? 揮發油包合物表征

包合物形成的表征方法有薄層色譜法、紫外光譜法、紅外分光光度法、顯微鑒別、熱分析法等^[8]，薄層色譜法和紅外光譜法最常用，且操作簡單;顯微鑒別可直接通過觀察包合物形狀判斷包合物是否形成，直觀明了?？紤]實驗室設備條件，本試驗采用顯微鏡法和紅外分光光度法進行包合物表征。

2.3.1? 顯微成像分析

通過顯微鏡觀察包合物和混合物的形態、晶型變化，判斷包合物是否形成^[10]。取β-CD、揮發油與β-CD物理混合物、包合物適量，過100目篩，分別放于載玻片上，滴加少量蒸餾水攪拌分散，蓋上蓋玻片，于400倍顯微鏡下觀察?？梢?，β-CD的顯微結構呈板塊狀結晶;物理混合物與β-CD的顯微結構相似，且混有油滴;包合物為黑色不透明的團狀物質，晶粒粒度小，無明顯油滴。結果表明揮發油被包合在β-CD中。

2.3.2? 紅外光譜分析

紅外分光光度法可通過比較揮發油包合前后紅外區特征峰的位移變化或吸收峰消失來判斷包合物是否形成^[11-12]。取包合前后揮發油、β-CD、揮發油與β-CD物理混合物、包合物適量，采用溴化鉀壓片法測定紅外光譜。由光譜數據分析可知，揮發油在2900～1700 cm^-1、1333～600 cm^-1處有明顯的吸收峰，其包合前后光譜曲線基本一致，表明在包合過程中揮發油主要成分性質基本沒有變化;在包合物和物理混合物中，部分揮發油吸收峰減弱或消失，且包合物呈現與β-CD相似的光譜曲線，表明揮發油已被β-CD包合。

3? 討論

本試驗優選的揮發油提取工藝確定為：加8倍量水，浸泡2 h，提取5 h;包合工藝確定為：β-CD（g）與水（mL）比例為1∶10，揮發油（mL）與β-CD（g）比例為1∶10，包合溫度40 ℃，包合時間1.5 h。驗證試驗表明，提取、包合工藝穩定可行。顯微鏡法和紅外分光光度法對包合物進行表征結果顯示，包合物形成。采用β-CD包合揮發油，不僅可以掩蓋不良氣味，同時可以提高藥物的穩定性，保證成品藥效。

試驗中發現，包合溫度對包合率的影響最大。隨著溫度的升高，β-CD在水中的溶解度增大，增加了與揮發油的接觸，從而提高包封率，但溫度過高則揮發油逸散損失，包合效果減弱。采用飽和水溶液法制備包合物多考察包合溫度、包合時間、揮發油與β-CD比例3個因素，對加水量的篩選研究不多，本試驗采用單因素法對加水量進行考察，結果表明，在保證水溶液飽和的前提下，加水量過多會導致包合物在水中溶解，包合物得率降低;加水量過少，則部分β-CD未溶解，影響包合物得率的準確性，且參與包合的β-CD減少，降低包封率。

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