快速測定乳制品中黃曲霉毒素B1、M1

李江，黎丁滔，綦艷，嚴家俊，邱啟東，佘之蘊

（廣東產品質量監督檢驗研究院,廣東佛山528300）

0 引 言

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，從其化學結構和產生衍生物的不同并經鑒定的約20種，其中AFB1、B2、G1、G2、M 1、M 2等危害性較大[1-2]。黃曲霉毒素 B1(AFB1)，分子量：312.3，分子式：C17H12O6，與致癌有關[3-4]。黃曲霉毒素M 1(AFM 1)是黃曲霉毒素B1(AFB1)的羥基化代謝產物，其外觀為白色或微黃色粉末，分子式為C17H12O7,分子量為328.3[5-6]，該毒素由Alleroft首先在牛奶中發現[7-8]，并命名為黃曲霉毒素M(Aflatoxin M)，主要有M 1和 M 2兩種，有致癌性[9-11]。由于AFB1，AFM 1都具有強致癌性，建立一種快速、準確的檢測方法具有重要意義，現對AFBI、AFM 1的檢測方法有薄層色譜法TLC（Thin Layer Chromatograph）[12-14]、高效液相色譜法HPLC(High Performance Liquid Chromatography)[15-20]、液相色譜-質譜聯用法HPLC-MS/MS(High performance liquid chromatography mass spectrometry/massspectrometry)[21-22]、ELISA（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）法等[23-25]，薄層色譜法只能定性且操作步驟繁瑣；高效液相色譜法和液質聯用法前處理復雜，檢測成本高，需要大型檢測設備；而ELISA法、操作步驟簡單、結果準確，檢測成本較低，適合不同樣本快速篩選及檢測，已廣泛應用于食品檢測、分析化學等領域[26-28]，新頒布實施的GB5009.22-2016食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定和GB 5009.24-2016食品中黃曲霉毒素M族的測定[29-30]，也將此法列入其中。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇，批號：20161028，天津大茂化學試劑廠提供；純水。

1.2 儀器與材料

MULTISKAN MK3酶標儀（Thermo），離心機（Sigma），電子天平(TIANFU)。

檢測樣品為牛奶，盒裝液體，市售，產品批號：20180517；AFB1、AFM 1標 準 品（sigma），批 號 ：20161206；AFB1、AFM 1質控品（中國檢科院），批號：20161122；AFB1、AFM 1 ELISA試劑盒，（江蘇美正生物技術有限公司）批號：20170927。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5.0±0.2 g樣本到三角瓶中，加入25.0 mL，60%的甲醇-水，樣品稀釋5倍，渦旋混勻放在振蕩器上振搖15.0 min，將混合液放入50.0 mL離心管中，6 000 r/min離心2.0 min，用濾紙過濾；取1 mL濾液到5.0 mL試管，加入4mL純水稀釋，總稀釋倍數25倍，待測。

1.3.2 樣本中AFB1、AFM 1的檢測

將試劑盒從冰箱取出，在室溫環境平衡60 min，按照試劑盒操作說明書，依次加入100μL AFB1標準品和樣本到微孔中，再加入50μL/孔AFB1酶標物、抗試劑，混勻，避光，于室溫環境孵育15min；孵育結束，倒掉微孔中的反應液，用250μL/孔洗滌液洗3～5次，接著在紙巾上拍打，去除洗滌液；加入100μL/孔顯色液，混勻，避光，于室溫孵育5～7 min；孵育結束，加入100μL/孔終止液，于450 nm波長處測定吸光度值。（AFM 1的樣本檢測和具體操作步驟同AFB1）

1.4 結果分析

用分析軟件（Rida soft）對檢測結果統計分析。

2 結果與分析

2.1 AFB1回收率結果

按試劑盒操作說明，取陰性質控品，分別添加0.2 μg/kg，0.4μg/kg和0.8μg/kg三個濃度標準品，計算回收率，結果見表1。

表1 AFB1回收率結果

從表1測定結果中可知：當加標濃度為0.2μg/kg時，回收率為105.0%；加標濃度為0.4μg/kg時，回收率為110.0%；加標濃度為0.8μg/kg時，回收率為103.8%；回收率結果均在50%～120%范圍，符合國標對回收率的要求。

2.2 AFM 1回收率結果

按試劑盒操作說明，取陰性質控品，分別添加0.2μg/kg，0.4μg/kg和0.8μg/kg三個濃度標準品，計算回收率，結果見表2。

從表2測定結果可知：當加標濃度為0.2μg/kg時，陰性樣品的回收率為100.5%；加標濃度為0.4μg/kg時，陰性樣品回收率為99.2%；加標濃度為0.8μg/kg時，陰性樣品的回收率為101.5%；3個標準濃度回收率均在50%～120%范圍，符合國標中對回收率的要求。

2.3 方法檢出限

表2 AFM1回收率測定結果

對10份陰性樣本進行檢測，計算AFB1、AFM 1的含量，方法的檢出限等于陰性空白樣本的檢測平均值加上陰性樣本檢測濃度的3倍標準偏差，結果見表3。

表3 AFM1方法檢出限結果（n=10）

3 結論

建立了一種快速檢測乳制品中AFB1、AFM 1的方法，AFB1的回收率分別為：98.7%、97.3%及103.6%；AFM 1的回收率為：100.5%、99.2%及101.5%；方法檢出限為0.03μg/kg。檢測方法快速、簡單、準確且靈敏度高，適用于對乳制品中AFB1、AFM 1的快速檢測。