奶牛乳腺分支模型的建立

崔英俊，于廣璞，湯云飛，李慧銘，邊艷杰，孫喆，劉智宇，孫霞

（東北農業大學生命科學院，哈爾濱150030）

0 引 言

奶牛乳腺分支形態發育是成功泌乳的基本條件。有效的乳腺分支結構能提高乳腺腺泡的數量和分泌功能，提高奶牛乳產量。乳腺發育過程由體內微環境構建龐大的激素網絡調控，其復雜程度對乳腺發育機理的研究造成困難，而乳腺體外模型有利于階段性的觀察。目前對乳腺分支模型的研究多見于小鼠和人，尚無關于奶牛乳腺分支模型的報道[1-3]。

本研究利用從青春期奶牛乳腺中提取的類器官，在I型膠原中以鑲嵌式進行三維培養，用FGF2處理來建立奶牛乳腺分支模型，旨在通過奶牛乳腺分支模型的建立，為進一步在體外研究奶牛乳腺分支的分子機理提供理論基礎。

1 實 驗

1.1 實驗動物及取材

處于青春期的健康荷斯坦奶牛，飼養管理條件一致。

1.2 試劑和儀器

Ⅳ型膠原酶，鼠尾Ⅰ型膠原，DMEM/F12，堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，FGF2），DnaseⅠ內切酶，胰島素/轉鐵蛋白/硒（insulin/transferrin/selenium，ITS）。

1.3 方法

1.3.1 奶牛乳腺類器官的獲取

取新鮮健康青春期荷斯坦奶牛乳腺組織，去除脂肪組織和結締組織后，清洗并剪成1 mm3的組織小塊。將組織小塊放入100 mL的DMEM/F12溶液（質量濃度為1 g/L的Ⅳ型膠原酶）中，于37℃搖床上消化3 h。將消化液用銅網過濾，濾液分裝在用質量分數為2.5%BSA預鋪好的10 mL離心管中，在轉速為1 500 r/min下離心15 min。將沉淀用DMEM/F12懸浮，加入濃度為2 000 U/mL的DnaseⅠ靜置后，轉速為1 500 r/min下離心10 min，收集沉淀。然后加入DMEM/F12溶液10 mL，重懸細胞沉淀。之后放入離心機中（1 500 r/min）3～4 s后停止，收集沉淀。此即為奶牛乳腺類器官沉淀。

將沉淀置于10 mL的DMEM/F12中充分混勻，從中轉移50μL的混液，置于血細胞計數板上，在光學顯微鏡下計數。將調整好質量濃度的混液以1 500 r/min室溫離心，收集沉淀。

1.3.2 奶牛乳腺類器官鑲嵌入Ⅰ型膠原

將鼠尾Ⅰ型膠原的pH值調到中性，然后用DMEM/F12培養液在冰上調節鼠尾Ⅰ型膠原質量濃度（終質量濃度3 g/L）。在鋪膠之前將鼠尾Ⅰ型膠原放在4℃冰箱中預冷1 h。

在24孔板上預鋪20μLⅠ型膠原，37℃放置待Ⅰ型膠原完全凝固后，將收集好的類器官沉淀與Ⅰ型膠原混勻，加在預鋪好的24孔板上，每個孔150μL。放入37℃的培養箱中1 h，待Ⅰ型膠原完全凝固，每孔加入2 mLDMEM/F12基礎培養液（含1×ITS），FGF2組另加入FGF2（終質量濃度50 ng/mL）。每隔2天換1次液。

1.3.3 奶牛乳腺三維培養的形態學觀察

在初加入培養基時利用相差顯微鏡拍照，此時定為0 h。分別在第0，12，36，60，84 h進行形態學觀察。

1.3.4 奶牛乳腺三維培養的分支率計算

選擇放大倍數為100倍的照片，每張照片隨機挑選3個不同視野，視野內類器官總數不少于50個，進行類器官計數。

分支率的計算公式為：具有分支形態的類器官/類器官總數×100%。

1.4 數據處理與分析

應用SPSS19.0統計分析軟件對奶牛乳腺分支率進行t檢驗。數據以平均數（M）±標準誤（SE）表示。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 奶牛乳腺類器官的獲取

將新鮮健康青春期荷斯坦奶牛乳腺組織剪成小塊，加入Ⅳ型膠原酶溶液中（質量濃度為1 g/L的Ⅳ型膠原酶），37℃消化3 h，過濾。將濾液分裝在預鋪好2.5%BSA的離心管中，1 500 r/min離心15 min，取上層脂肪層再次混勻離心，收集兩次沉淀，沉淀在鏡下觀察如圖1a?？梢娂毎杏行鯛钗镫s質。加入2 000 U/mL的DnaseⅠ混勻靜置5 min，靜置后，在鏡下觀察見絮狀物消失（圖1b）。重懸細胞沉淀，放入離心機中（1 500 r/min）3～4 s，差速離心后收集沉淀可見單細胞基本清除，剩下團狀的細胞組織（圖1c）。詳細流程如圖2所示。

圖1 奶牛乳腺類器官的提取過程中的鏡下觀察

2.2 奶牛乳腺三維培養的形態學觀察及分支率計算

通過形態學觀察發現，對照組在84 h內無分支形態出現（圖3A1-A5）；FGF2組在36 h時鏡下即可見分支形態（圖3B3）。分支率計算的結果表明，從36 h開始，FGF2組分支率顯著高于對照組（P＜0.05）（圖4）。

A1-A5分別代表對照組乳腺上皮類器官在0，12，36，60，84 h的形態學變化；B1-B5分別代表FGF2乳腺上皮類器官在 0，12，36，60，84h的形態學變化（200×）。

3 結果與討論

乳腺與肺、腎、唾液腺等上皮器官一樣，能通過分支形態發生而形成樹狀結構[4]。細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）是體內平衡和組織表型的關鍵調節物，它為乳腺上皮細胞提供細胞因子，提供生物力學支撐，并參與細胞膜表面的信號傳導[5]。早期研究認為驅使乳腺上皮侵入脂肪墊并形成分支的過程，與ECM重塑相關的酶有關[3]。

圖2 奶牛乳腺類器官的提取流程

圖3 奶牛乳腺上皮類器官在三維培養中的形態學變化

圖4 奶牛乳腺上類器官在三維培養中的分支率

在對乳腺分支形態發生進行體外研究時，三維培養能比二維培養更好得模擬體內情況，在研究細胞行為和功能方面更有說服力[6]。青春期的乳腺分支結構，可以通過將乳腺上皮細胞鑲嵌在Ⅰ型膠原中，并用細胞因子刺激來進行三維培養而重現[4，7]。Ⅰ型膠原是正常乳腺ECM中最豐富的成分[5，8]。之后人們通過在Ⅰ型膠原中鑲嵌培養稱為類器官的小塊雌性小鼠乳腺腺體，在體外也重現了乳腺導管發育。乳腺分支形態形成還取決于細胞因子的相互作用，在I型膠原中培養乳腺上皮細胞時，乳腺分支被肝細胞生長因子、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF)-α、FGF7和FGF2上調，被TGF-β家族成員抑制，但是這些細胞因子的作用機制還需要進一步研究[9-10]。

本研究將自青春期奶牛乳腺組織中獲取的類器官鑲嵌在Ⅰ型膠原中進行三維培養，發現在FGF2作用下，與對照組相比，奶牛乳腺類器官自36 h開始就具有了明顯的分支形態，且之后分支率一直顯著高于對照組，說明已成功建立奶牛乳腺分支模型，這與在人和小鼠中得到的結果相一致[2-3]，證實了乳腺分支模型的建立方法在反芻動物中也同樣可行。這個模型也將為奶牛乳腺分支相關機理的研究提供物質條件和理論基礎。