氮缺乏對保加利亞乳桿菌胞內肽酶基因表達的影響

趙悅含，姜夢婷，高達，劉飛，杜鵬，侯俊財

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室食品學院，哈爾濱150030）

0 引 言

乳酸菌主要是依靠自身蛋白水解體系來為其菌體提供營養，不能直接利用外源蛋白質[1-2]。乳酸菌蛋白水解體系包括胞外酶、轉運系統和多種胞內酶。主要包括以下三步：大分子酪蛋白在胞外蛋白酶的作用下降解成多肽；寡肽轉運體系將水解后的多肽轉運至胞內；胞內肽酶再使轉運至胞內的多肽產生乳酸菌生長所需的各種游離氨基酸和短肽，最終進行氨基酸代謝或合成蛋白質[3-4]。乳酸菌通過上述的蛋白水解體系逐步將外源蛋白質水解成供菌體自身營養和生長所需的肽和小分子游離氨基酸[2]。乳酸菌完全利用胞內多肽通常需要肽鏈內切酶、氨肽酶、二肽酶和三肽酶這幾種酶協同作用[1]，且乳酸球菌的蛋白水解能力比乳酸桿菌低，主要是因為乳酸桿菌的胞內肽酶多且胞內肽酶的表達水平較高[5]。有關研究表明，不同胞內肽酶作用于多肽的不同位點且即使是同一種肽酶作用位點也可能不同[6]。蛋白水解體系中各種關鍵蛋白酶基因的表達在不同菌株、同一菌株不同生長階段以及不同的菌體生長環境都會有所差異，如氮源含量、氮源種類、培養基的溫度和初始p H等都會對關鍵蛋白酶基因的表達產生影響?；诖?，本試驗選取保加利亞乳桿菌作為研究對象，分析氮缺乏對保加利亞乳桿菌胞內肽酶基因表達的影響，為進一步深入研究保加利亞乳桿菌生長代謝變化的分子生物學機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

選用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus） LB08006、 LB08007、 LB08012、 L08014、LB08015、LB08016、LB08017作為研究對象，上述菌株均由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室(KLDS)乳酸菌菌種庫提供。

1.2 培養基

培養基的成分詳見表1，使用前需將培養基pH調至6.2，并于121℃滅菌15 min，4℃保存備用。

表1 培養基

1.3 菌株的活化與保存

先將菌株接入MRS液體培養基中活化兩代，培養條件為42℃、16～18 h。而后接入MRS固體培養基中純化，培養24 h后挑取單菌落并接種于MRS液體培養基中培養12 h，備用。菌株于20%甘油中-80℃保存。

1.4 基因表達的檢測方法

基因表達檢測方法采用qRT-PCR技術，現已被廣泛應用于鑒別乳酸菌以及檢測乳酸菌中基因的表達差異[7-10]。根據本試驗研究目的采用qRT-PCR技術并采取熒光染料法進行相對定量分析。

1.5 關鍵酶基因在不同菌株之間的表達測定

將7株保加利亞乳桿菌活化兩代后接種于MRS液體培養基（42℃發酵18 h），再分別提取菌體RNA并檢測其完整性和濃度，而后反轉錄為cDNA，再對樣品進行qRT-PCR檢測。

1.6 胞內肽酶基因在氮缺乏培養下的表達測定

將菌株活化兩代后分別接種于MRS液體培養基和氮缺乏液體培養基中42℃發酵12 h，分別提取菌體RNA并檢測其完整性和濃度，而后反轉錄為cDNA，再對樣品進行qRT-PCR檢測。

1.6.1 胞內肽酶基因及管家基因的確定

乳酸菌等細菌在熒光定量PCR實驗中所使用的管家基因選擇比較普遍且穩定性較好的16SrRNA[11-17]。選擇保加利亞乳桿菌蛋白代謝過程中的幾種胞內肽酶基因（見表2）作為本試驗的目的基因。

1.6.2 PCR引物設計與合成

依據Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusATCC 11842的DNA序列（GenBank accession number:NC_008054.1）中相應基因序列，使用primer5.0軟件設計基因的引物序列并由上海生工生物技術有限公司合成16SrRNA，引物詳見表3。

1.6.3 RNA的提取及檢測

使用RNAprep pure培養細菌總RNA提取試劑盒（天根），按說明分別依次提取在氮缺乏環境和MRS液體培養的菌株RNA，提取時所用的槍頭和離心管需要在濃度為1/1 000的DEPC溶液中浸泡過夜，再經121℃，30 min高溫高壓的滅菌處理。注意需使用DEPC處理水配置溶液以防止RNA酶污染。

用溴化乙錠（EB）對樣本進行染色，取3μL RNA樣液和2μL的Loadingbuffer于1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V，15 min)，經CDS8000型凝膠分析系統成像后，觀察16 s和23 s電泳條帶，判斷RNA的完整性。

對所提取RNA在260 nm、280 nm處的吸光度進行測定，判斷RNA的濃度[18]。

1.6.4 反轉錄合成cDNA

反轉錄使用PrimeScript?RT反轉錄試劑盒且所得的cDNA樣本（保存于-20℃）用于qRT-PCR檢測。

表2 實時定量PCR的目的基因

表3 實時熒光定量PCR引物

表4 RT反應液成分

利用得到的cDNA以及合成的引物先進行普通PCR試驗，而后進行凝膠電泳觀察擴增產物的條帶的大小和亮度，確保RNA提取成功以及引物特異性完好。

1.6.5 實時熒光定量PCR

使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（Takara公司）配置PCR反應液，使用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System進行qRT-PCR試驗，反應體系及方法參照杜越歐和侯俊財的方法[19]。

1.7 數據處理與分析

本研究采用2-△△CT法評估目的基因的相對表達量[16,19]。先用Excel對數據進行初步整理，而后的方差分析采用SPSS（11.5）軟件進行整理，P＜0.05為差異顯著。

2 試驗結果

2.1 RNA的純度及完整性

試驗得到的RNA樣品經電泳分析結果如圖1所示，由圖可見完整的23S條帶和16S條帶，這表明RNA的降解程度很小且樣品的質量完好。經檢測所得的OD260／OD280的數據比值均在1.8～2.0之間，這表明RNA純度較高。同時，如果RNA樣品被基因組DNA污染也會造成后續PCR實驗產生非特異性擴增，導致RNA的表達量高于實際量，本實驗在總RNA提取試劑盒中配備了DNA酶（DNase I），有效的取出了基因組DNA。經以上檢測可知實驗中所得的RNA樣品可用來進行后續的實時熒光定量PCR實驗。提取的RNA樣品經反轉錄合成cDNA后，先要經過普通PCR試驗，通過凝膠電泳觀察到條帶亮度適宜、無雜帶且大小與目的基因相符，由此證明反轉錄過程中沒有污染且引物特異性良好。

圖1 RNA樣品電泳圖

2.2 實時熒光定量PCR結果

各樣本cDNA經實時熒光定量PCR試驗所得目的基因以及管家基因的熔解曲線，見圖2。由圖可見曲線均呈現出單一峰，由此能夠排除實驗過程中形成引物二聚體和非特異產物對試驗結果所產生的的影響，且引物的特異性良好。

以循環圈數為橫坐標，熒光強度變化值為縱坐標繪制擴增曲線，經qRT-PCR試驗得的擴增曲線見圖3，可以看出管家基因和各目的基因的擴增效率較高，穩定性和CT值的重復性較好，得到的CT值可用于分析試驗結果。

圖2 管家基因和目的基因PCR產物的熔解曲線

2.3 不同菌株之間關鍵酶基因的表達情況分析

不同菌株間胞內肽酶基因的表達情況見圖4，并將菌株LB08006作為參照菌株。與參照菌株相比其他6株菌中的PepC、PepF、PepQ這三種目的基因的表達量均下降，其中前兩種基因在菌株LB08007中表達量最低，PepQ基因在菌株LB08012中的表達量最低。PepT基因在菌株LB08007、LB08014和LB08015中的表達量上調，但是與參照菌株相比其上調幅度不顯著，并且在其他菌株中該基因的表達量下降。PepX基因在菌株LB08014中的表達量顯著上升（P＜0.05），在其他五株菌中表達量均顯著下降且在菌株LB08015中下降幅度最大。

圖4 不同菌株之間目的基因的表達情況

2.4 氮缺乏對各目的基因表達的影響

2.4.1 氮缺乏對PepC基因的表達的影響

氮缺乏對pepC基因的表達的影響見圖5。氮缺乏培養條件下的pepC基因表達水平呈顯著下調趨勢（P＜0.05），平均下降了2.8倍，其中菌株LB08006下降最少，菌株LB08007、LB08016和LB08017下降幅度較大。

圖5 氮缺乏培養下pep C基因表達的動態變化

2.4.2 氮缺乏對pepF基因的表達的影響

氮缺乏對pepF基因的表達的影響見圖6。氮缺乏培養條件下的pepF基因表達量顯著上調（P＜0.05），平均上調3.2倍，其中菌株LB08006、LB08014和LB08015的上調幅度較大，而菌株LB08012的上調幅度是最小的。

圖6 氮缺乏培養下pep F基因表達的動態變化

2.4.3 氮缺乏對pepQ基因的表達的影響

氮缺乏對pepQ基因的表達的影響見圖7。在氮缺乏培養條件下，菌株LB08006、LB08007和LB08015中的pepQ基因表達量顯著上升（P＜0.05），平均上調2.6倍；而在其他4株菌中顯著下調（P＜0.05），平均下調1.7倍。

圖7 氮缺乏培養下pep Q基因表達的動態變化

2.4.4 氮缺乏對pepX基因的表達的影響

氮缺乏對pepX基因的表達的影響見圖8，7株菌中的pepX基因的表達均呈顯著下調趨勢（P＜0.05），平均下調1.8倍。其中菌株LB08012和LB08016下調幅度較大。

圖8 氮缺乏培養下pep X基因表達的動態變化

2.4.5 氮缺乏對pepT基因的表達的影響

氮缺乏對pepT基因的表達的影響見圖9。在氮缺乏培養條件時，菌株LB08006、LB08007和LB08015中的pepT基因表達量顯著上升（P＜0.05），平均上調了1.4倍 ；而 在 菌 株 LB08012、LB08014、LB08016、LB08017中顯著下降（P＜0.05），平均下調了2.6倍。

圖9 氮缺乏培養下pep T基因表達的動態變化

3 討 論

目前對乳酸乳球菌的蛋白水解系統已經進行了一系列的研究，對參與酪蛋白降解、寡肽的利用以及一些肽的分解路徑有了深入的了解[20]。保加利亞乳桿菌蛋白水解體系中關鍵肽酶基因的表達不僅僅與菌株差異有關，還會受到其他因素影響，如pH[21-22]、菌株生長階段[23]、培養溫度[24]等。雖然關于瑞士乳桿菌和保加利亞乳桿菌的研究也有一定的進展，但是還有許多問題沒有探明，尤其是菌株間胞內肽酶基因表達差異及氮環境對菌株胞內肽酶基因表達影響還未涉及。

本試驗結果表明，胞內肽酶基因的表達水平在不同菌株之間差異顯著，這與呂加平等[25]研究結果一致，主要是因為菌株間的差異性，但規律性不強，足以說明胞內肽酶基因表達情況不僅受菌體自身影響還會受到外界因素影響。在進行乳酸菌培養時，氮源供給量對于菌體蛋白水解體系中胞內肽酶基因的表達是一個限制性因素，氮缺乏對胞內肽酶基因表達產生影響。Guédon等[3]詳細分析了不同環境中Lactococcus lactisMG1363蛋白水解體系16個基因的表達變化，研究發現表達水平較高的蛋白水解酶基因受氮源的影響，表達水平較低的基因不受肽供應的影響，本試驗研究發現氮缺乏環境下各胞內肽酶基因的表達量的表達情況因菌株不同而不同，這正如Guédon等認為的受菌株自身的生物學特性影響。除了pepC和pepX基因，其他三個目的基因的表達量在氮缺乏培養時均顯著升高（P＜0.05），這與Vermeulen等[7]研究結果一致，Lactobacillus sanfranciscensisDSM 20451T在面團中生長至對數期時，oppF、dtpT和pepT三個基因的表達量與添加肽的面團基因表達相比，基因的表達量都在未添加肽的面團中最高。這種情況可能是因為酪蛋白胨和大豆蛋白胨中含有乳酸菌生長所需的各種氨基酸、寡肽及生長因子等。菌體在生長初期利用這些氮源大量繁殖，使游離氨基酸和短肽大量積累，縮短菌體進入對數期所用的時間，使其提前進入穩定期。但與方芳等研究結果有所不同，研究發現有機復合氮源能夠促進菌體的生長，為菌體提供多種營養物質且產酶活力高，而在無機氮源培養基中培養時菌體生長緩慢[26]，主要原因是無機氮源使培養基pH值過低、氮源缺乏，從而抑制乳酸菌生長。

4 結論

本試驗結果表明，氮缺乏培養條件下，pepF基因表達量比MRS液體培養條件下顯著上調（P＜0.05），平均上調3.2倍，而pepX和pepC基因表達水平呈顯著下調趨勢（P＜0.05）；氮缺乏培養條件下，菌株LB08006、LB08007和LB08015中pepT和pepQ基因表達量上調，而在菌株 LB08012、L08014、LB08016和LB08017pepT和pepQ基因表達量則是下調的。因此，氮缺乏可顯著影響保加利亞乳桿菌胞內關鍵肽酶基因的表達，且在不同菌株間表現出不同的表達量,培養基中氮源的供給是保加利亞乳桿菌的胞內肽酶基因表達限制性因素之一。