冷凍切片機在細胞塊制作中的應用

劉澤平(通信作者)，鐘福杭，蔣小英，湯曉暉

1 福建省龍巖市第二醫院病理科 (福建龍巖 364000)；2 福建省上杭縣醫院病理科 (福建龍巖 364200)；3 福建省龍巖市第一醫院病理科 (福建龍巖 364000)

細胞塊技術已廣泛應用于臨床病理工作中，并能同時應用免疫組織化學及分子病理檢測，能提高診斷的靈敏度及特異度。目前制作細胞塊主要有試管包埋法、普通離心沉淀法、血清凝聚法及瓊脂凝聚法等[1-4]，但若標本的細胞量較少則難以制作成組織塊。本研究介紹一種操作簡單、費用低，但制成的組織塊細胞量較多的細胞塊制作方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年1月至2017年12月龍巖市第一醫院、龍巖市第二醫院病理科胸腹水樣本共168例，要求樣本細胞量較大，在制作常規細胞涂片后有剩余足量細胞量以便制成細胞塊，同時有活檢或手術標本并有明確診斷。樣本中女87例,男81例,年齡35～86歲,平均 (59.6±5.9) 歲。本研究得到兩醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1傳統細胞病理學檢查

(1)送檢標本靜置20～30 min；(2)棄上清液，取底部沉積物40 ml于離心管中，2 500 r/min離心5 min，棄上清液；(3)將所得細胞沉淀物與中性福爾馬林按1∶2比例混勻，靜置1～4 h后，以2 500 r/min離心5 min，棄上清液；(4)用棉簽將部分標本單向、均勻地涂抹于載玻片上；(5)進行常規蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-Enosin staining，HE染色)，試劑均由珠海貝索生物技術有限公司提供，按試劑盒上流程操作。

1.2.2細胞塊制備

(1)將1.2.1中所余標本的試管放置冷凍切片機凍臺上(LECAI 德國，CM1520)，(溫度：-18℃至-25℃，時間5～8 min)，使沉淀物形成冰塊；(5)將試管放置80℃左右水中，時間3～4 min，讓緊貼試管的冰塊稍融化；(6)將試管倒置顯微鏡拭鏡紙上，使細胞塊與試管分離；(7)細胞塊表面滴些冷凍切片膠水，用拭鏡紙封包；(8)上述細胞塊可按常規組織進行脫水、浸蠟、包埋、切片等處理制成細胞蠟塊。

1.2.3染色方法

(1)常規HE染色(操作同1.2.1)；(2)免疫組化染色，用快捷免疫組化S-P法染色；二氨基聯苯胺(DAB)及Maxvision試劑盒，二抗：廣譜細胞角蛋白(Cytokeratin-Pan CK-Pan,鼠抗人單克隆抗體)、Ki-67(鼠抗人單克隆抗體)等均由邁新公司(福州)提供，并由主管病理技師操作以確保實驗準確性。

1.3 顯微鏡閱片

均采用雙盲法，由兩名細胞病理學高年資主治醫師同時閱片，并做出一致性診斷。依據《漿膜腔積液細胞病理學診斷》標準，診斷報告采用3級分類法，即找到惡性細胞(鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞未分化癌、大細胞未分化癌、腺鱗癌、癌型未定)為陽性，可疑惡性細胞為不確定性，及未找到惡性細胞為陰性。綜合活檢或手術標本常規病理為最終確診結果。

1.4 統計學處理

采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗， 等級資料采用秩和檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果

采用上述方法制備細胞塊，收集的細胞完整，不易碎，對細胞量較少的標本也能比傳統方法收集較多量細胞；且成本低，操作簡單。HE染色中細胞結構清晰，紅染及藍染染色鮮艷，細胞核、核染色質顆粒清楚,核膜清晰,均質深藍染色,核仁明顯呈紫紅色,顏色鮮艷，對比性強，無背景著色；同時可以看到腫瘤組織結構，見圖1。

2.2 免疫組織化學染色結果

抗體CK：癌細胞胞漿黃染顆粒定位準確，其他部位未見黃染顆粒(圖2)?？贵wKi-67：腫瘤細胞胞核黃染顆粒定位準確，對比性較強，其他部位未見黃染顆粒(圖3)。

圖1 HE染色,x200圖2 CK-Pan S-P法免疫組化染色x200圖3 Ki-67 S-P法免疫組化染色x200

2.3 兩種方法診斷情況比較

168例樣經高年資主治醫生診斷后，細胞塊診斷情況優于傳統細胞學，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩種方法診斷情況比較(n %)

注：兩種方法比較，χ2=91.17，P<0.05

3 討論

細胞塊方法最早于1896年由Bahrenburg創造[5]，目前我國臨床病理工作中，制作細胞塊的方法很多，且各有優點[1-4]。本研究所用方法由于冷凍前已將細胞充分用中性福爾馬林固定，因此細胞冷凍不會破壞其酸堿性及丟失表面抗原，離心加冷凍提高了細胞收集率，且細胞保存良好，無皺縮和變性，蘇木精把胞核染成藍色,伊紅把胞質染成紅色，以及抗體定位準確及表達強度較高的免疫組織化學切片，最終能制出高質量HE染色[9]。168例樣本通過本方法明顯提高了陽性確診率，減少了不確定(可疑)率；且極大的減少了誤診率，為臨床繼續治療提供更無創的確診方法。

細胞塊比傳統細胞學能作出更明確的細胞病理學診斷，該技術也是簡單，安全，經濟且可重復的[10]。細胞塊為形態學提供了最佳環境，背景染色非常少，診斷結果最接近組織病理學診斷[11]。胸水或腹水中的惡性細胞幾乎均是轉移性腫瘤，間皮細胞引起的原發性惡性腫瘤并不常見。惡性細胞的及時診斷是癌癥患者的重要預后指標[12]。惡性胸水是肺癌、乳腺癌和胃癌等晚期癌癥的常見并發癥和適應癥。惡性腹水是由于卵巢癌、結腸癌、肝癌和胰腺癌導致的。因此，診斷胸水、腹水是否存在惡性細胞已被作為癌癥的常規診斷程序。細胞塊比傳統細胞學更能突顯腫瘤的組織結構，也有更多組織切片便于免疫組化及基因檢測等。

由于診斷醫師業務有待提高，導致細胞塊存在個別誤診，因此本方法也得基于專業水平較高醫生的前提下才能更有效開展。組織學檢查雖為目前診斷的“金標準”，但取材較困難，費用較高。本方法操作簡易，成本低，可操作性強。