采用PCR-RFLP法鑒別IBDV強毒BC6／85株和弱毒B87株

陳仕怡，陳 媛，賴隆永，李春燕，劉夢茜，袁曉琴，鄭慶禮，許麗惠，王全溪

(福建農林大學動物科學學院，福建福州350002)

傳染性法氏囊病是由雙股核糖核酸病毒家族的傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的具有免疫抑制性和高度接觸性傳染病[1]；IBDV強毒株會引發機體出現嚴重的損傷和病變，疫苗株則造成可逆性損傷[2].因此，準確鑒別強毒株和弱毒株對于制定IBDV的防治策略有著重要意義.目前，檢測IBDV的方法主要有實時熒光定量PCR、酶聯免疫吸附試驗、免疫組織化學和環介導等溫擴增技術等，但這些方法大多無法有效地區分不同毒力株的病毒[3-6].限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-restrition fragment length polymorphism，PCR-RFLP)是在PCR和DNA序列分析的基礎上產生的RFLP技術.DNA片段經PCR擴增后，選擇適當的限制性內切酶消化，可得到特異性電泳圖譜[7].

IBDV結構蛋白VP2是病毒粒子衣殼結構的主要成分，該蛋白為IBDV抗原集中區，可誘導細胞凋亡，具有決定病毒毒力及抗原變異等重要作用；同時，VP2基因具有高變區，極易突變，也參與決定了IBDV的繁殖力和繁殖速度[8-10].通過建立IBDV強、弱毒株的PCR-RFLP鑒別診斷方法，可為臨床實踐中IBDV強、弱毒株的快速鑒別診斷和流行病學調查提供一種便捷的方法，也可為IBDV的預防與治療提供依據.

利用PCR-RFLP檢測IBDV的方法較多，目前國內多采用SspⅠ作為鑒別vvIBDV的內切酶[5].楊蒙等[11]選取AhaⅠ、StuⅠ和BamHⅠ、NspⅠ兩組限制性內切酶進行試驗，發現其能夠分別對超強毒株、強毒株和疫苗株進行酶切鑒定.本試驗根據IBDVVP2基因保守區設計一對通用引物和兩個限制性內切酶位點(BamHⅠ和PstⅠ)，采用PCR-RFLP分析酶切產物，可以準確性、高效率鑒別診斷IBDV強毒株和弱毒株.研究結果可為快速鑒別IBDV強、弱毒株提供可靠的方法.

1 材料與方法

1.1 材料

IBDV弱毒B87株、IBDV強毒BC6/85株及傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)、雞新城疫病毒(newcastle disease，ND)、雞淋巴細胞性白血病(lymphoid leukosis virus，LLV)、禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)、禽4型腺病毒(fowl adenovirus serotype-4，FAdV-4)、腺病毒的標準陽性核酸，由福州某生物技術有限公司提供.

病毒RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，PCR試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，限制性內切酶BamHⅠ和PstⅠ購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 參考GenBank中IBDV B87株和BC6/85株的VP2共保守區段，通過基因序列分析軟件及引物設計分析軟件DNAman 6.0、Primer Premier 5.0設計引物(上游引物：5′-AGGAAGCCTGAGTGAACTGACA-3′；下游引物：5′-TGGCATCAAGACCGTCTGGCC-3′)，預計目的片段的長度為 856 bp.1.2.2 病毒RNA的提取 按照病毒RNA提取試劑盒操作步驟提取病毒RNA，置-80℃下保存或立即反轉錄成cDNA.

1.2.3 PCR擴增與鑒定 按照常規反轉錄體系和反應條件在20 μL體系中進行反轉錄.反轉錄體系和反應條件為：2 μL RNA 模板、4 μL 5×反應緩沖液、2 μL 25 mmol·L-1氯化鎂、1 μL 隨機引物、1 μL 寡聚胸腺嘧啶引物、1 μL 10 mmol·L-1PCR核苷酸混合液、1 μL逆轉錄酶、0.5 μL核糖核酸酶抑制劑，用無核酸酶水補足至20 μL，于42℃孵育15 min，72℃加熱15 min.根據常規PCR反應體系(50 μL)將反轉錄所得的產物再用上、下游引物進行 PCR擴增.PCR擴增體系為：2 μL cDNA模板，上、下游引物各2 μL，25 μL 2×PCR預試劑(含染料)，加無核酸酶水補足至50 μL.反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃擴增30 s，這3個步驟循環35次，最后于72℃延伸10 min，于4℃結束反應.取擴增完成的PCR產物30 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因片段的大小，與標準的DNA分子量標準物，如DL2000 Marker或Trans2K Plus DNA Marker進行比較，以查看是否擴增出856 bp的特異性片段，與預計的目的片段是否相一致.

1.2.4 目的基因的回收與測序 按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒的要求回收目的基因，取10 μL送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，與GeneBank上的基因序列進行比對.

1.2.5 酶切鑒定 取“1.2.4”中回收的目的基因，用BamHⅠ和PstⅠ酶切，反應體系和反應條件為：20 μL純化的 PCR 目的片段(≤0.4 μg)、6 μL 10×快切酶緩沖液、1 μL 快切酶BamHⅠ、1 μL 快切酶PstⅠ，用無核酸酶水補足至60 μL，于30℃孵育30 min，再加入PstⅠ孵育2 h.用2%瓊脂糖凝膠電泳(95 V、27 min)鑒定酶切片段的大小.

1.2.6 特異性檢測 按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法檢測正常的雞組織、IBV、IBDV、ND、LLV、ARV和FAdV-4.

1.2.7 敏感性檢測 取IBDV BC6/85株RNA作10的倍比稀釋成2 000、200、20、2、0.2和0.02 pg，各取1 μL分別按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法進行PCR擴增與鑒定，觀察結果，確定其最低的檢測量.

1.2.8 重復性檢測 按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法分別對IBDV BC6/85株和B87株陽性樣本的目的基因進行酶切，重復3次.

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

分別提取IBDV BC6/85株和B87株的RNA，反轉錄后進行PCR擴增，均得到大小為856 bp的目的基因條帶(圖1)，與預計期望得到的擴增目的基因條帶片段的大小相一致.

2.2 PCR產物測序結果及酶切位點

將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并進行酶切位點分析.結果表明，BC6/85株的目的片段具有BamHⅠ和PstⅠ限制性內切酶位點，而B87株的目的片段僅有一個PstⅠ限制性內切酶位點(圖2、圖3).

圖1 IBDV BC6／85株和B87株VP2基因的RT-PCR擴增產物Fig.1 RT-PCR amplification products of VP2 gene for IBDV BC6/85 and B87

圖2 IBDV BC6／85株目的片段的酶切位點Fig.2 Restriction site of the target fragment in BC6/85 strain

圖3 IBDV B87株目的片段的酶切位點Fig.3 Restriction site of the target fragment in B87 strain

2.3 酶切鑒定結果

PCR產物經DNA回收試劑盒回收目的基因，用BamHⅠ和PstⅠ雙酶切后，IBDV BC6/85株被切出166、242和449 bp大小的3條目的條帶(圖4)，而B87株僅能被PstⅠ切出242和615 bp大小的2條片段(圖5).

圖4 IBDV BC6／85株RT-PCR產物的BamHⅠ、PstⅠ酶切圖譜Fig.4 Restriction map of IBDV BC6/85 cut by BamHⅠand PstⅠ

圖5 IBDV B87株RT-PCR產物的BamHⅠ、PstⅠ酶切圖譜Fig.5 Restriction map of IBDV B87 cut by BamHⅠ and PstⅠ

2.4 特異性檢測結果

抽提正常雞組織、IBV、NDV、LLV、ARV、FAdV-4及IBDV BC6/85株、B87株的mRNA進行PCR-RFLP擴增.結果表明，只有IBDV BC6/85株和B87株的PCR擴增結果出現856 bp大小的片段，其他6個樣品沒有出現目的片段(圖6)；同時，只有IBDV BC6/85株和B87株的酶切結果出現相應的酶切圖譜(圖7).可見，本試驗建立的鑒別方法具有較好的特異性.

圖6 PCR特異性檢測結果Fig.6 Specificity of PCR

圖7 酶切特異性檢測結果Fig.7 Specificity of enzyme digestion

2.5 敏感性檢測結果

分別取 1 μL 2 000、200、20、2、0.2 和 0.02 pg BC6/85株的 cDNA進行 PCR擴增，只有 0.02 pg BC6/85株的cDNA進行PCR擴增后不出現目的片段，其他5個均能擴增出相應的目的條帶，表明該方法可以檢測到0.2 pg的核酸(圖8).

2.6 重復性檢測結果

分別選取3份相同的IBDV BC6/85株和B87株cDNA進行PCR-RFLP，BC6/85株3份樣品均在166、242和449 bp處得到清晰可見、與目的條帶一致的片段(圖9)；B87株3份樣品均在242和615 bp處得到與目的條帶一致的片段(圖10).

圖8 酶切敏感性檢測結果Fig.8 Sensibility of enzyme digestion

圖9 IBDV BC6／85株PCR重復性檢測結果Fig.9 Repeatability of PCR for IBDV BC6/85

圖10 IBDV B87株PCR重復性檢測結果Fig.10 Repeatability of PCR for IBDV B87

3 討論

劉玉鋒[12]研究表明：不同毒力的IBDV毒株致死率不同，感染后3 d，BC6/85株感染組雞群出現嚴重的臨床癥狀和免疫器官病變，而B87株接種組則未表現出臨床癥狀，非免疫器官也并無損傷；而免疫器官僅在感染后3 d出現輕度損傷，且巨噬細胞也出現了增加的現象.因此，準確鑒別強毒株和弱毒株對于制定IBDV的防治策略有著重要意義.

PCR-RFLP在禽類病毒鑒別診斷中的應用十分廣泛.唐熠等[13]等采用PCR-RFLP提取病畜血清鑒別Ⅰ群禽腺病毒的12個血清型，該方法具有快速、低成本的優勢，提高了腺相關病毒的臨床診斷和防治效率.本試驗先通過PCR擴增目的DNA，之后利用限制性內切酶進行酶切鑒定，提高了目的DNA的含量及相對特異性、靈敏度，同時降低了IBDV的檢測成本.

利用本試驗設計并合成的特異性引物，對兩種IBDV毒株的RNA進行RT-PCR擴增，能檢測出一條PCR特異性條帶，擴增出的DNA目的片段大小為856 bp，與試驗設計時預期的目的片段一致.選取BamHⅠ和PstⅠ限制性內切酶進行酶切鑒定，發現其能夠對超強毒株BC6/85和弱毒株B87進行酶切，獲得兩種結果.可見，本試驗采用的這種RT-PCR-RFLP方法能夠較好地區分兩種毒株，該法特異性強且試驗時間短，為IBDV強毒株和弱毒株的快速鑒別診斷及流行病學調查提供一種新的有效方法，同時為疫苗研發過程中對疫苗株的驗證和鑒定提供新思路，為IBDV的預防與治療提供參考.