北五味子中總木脂素類成分的抗氧化及抗炎活性研究

馬瑩慧，馮波，朱鶴云，郭淑英，張慧鋒，于歡

（吉林醫藥學院 藥學院，吉林 吉林 132013）

五味子屬木蘭科植物，是傳統中藥材，主要產地為東北三省。五味子性溫、味酸、甘、有益氣生津、收斂固澀、補腎寧心、保護腦神經細胞、抗腫瘤等功能。對久瀉不止、久嗽虛喘、短氣脈虛、心悸失眠等癥均有良好治療作用[1]。五味子醇提物主要含有木脂素、多種油性成分、多糖、全氮及氨基酸等成分，其中木脂素類為主要活性成分，為一種天然化合物，具有抗氧化、保肝、抗炎等作用[2-5]。例如苑廣信利用過氧化氫誘導氧化損傷的胰島細胞RINm5F 為模型，通過噻唑藍比色法（hiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、檢測細胞內和培養液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（model driven architecture，MDA）含量來研究五味子提取物的抗氧化活性及機制，結果顯示五味子提取物對胰島細胞有增殖作用，并呈劑量依賴性；五味子提取物還對過氧化氫誘導氧化損傷的胰島細胞有保護作用，通過與模型組對比，顯示其具有濃度依賴性的抗氧化保護作用；當五味子提取物高時、中劑量組培養液和細胞內MDA 含量明顯減少、SOD活力明顯增強，說明細胞的抗氧化能力增強[6]。姚瑩等采用四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷模型，比較了南、北五味子中木脂素對小鼠血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）活性及肝組織勻漿MDA 水平的影響，并同時觀察肝組織病理學改變。結果發現南、北五味子中木脂素均能明顯降低急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量，降低肝組織MDA 的水平，肝臟病理損傷有明顯的改善[7]。本試驗選取5種木脂素成分對照品作為定量指標，對五味子中木脂素化合物進行純化，并研究其抗氧化、抗炎作用及機制，為今后更深一步的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀：日本島津公司；Rotavapor R-3 旋轉蒸發儀：瑞士步琦有限公司；98-1-C型數字控溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司；Scientz-12SN 冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800 型紫外分光光度計：上海奧析科學儀器有限公司；T-100 酶標儀：美國伯樂公司；Heal ForceHF90 CO2培養箱：上海力新儀器有限公司。

1.2 試劑及材料

北五味子：市售；五味子醇甲（Y17M8H31887）、五味子醇乙（P28S6F3984）、五味子酯甲（SO1030KA12）、五味子甲素（Z21A8B34395）、五味子乙素（P29J8066）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（分析純）：江蘇漢邦科技有限公司；乙腈（色譜純）：美國Tedia 公司；HPD100型樹脂：東鴻化工有限公司；一氧化氮（NO）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒：南京建成生物工程研究所；VC對照品：上海源葉生物科技有限公司；鄰苯三酚：天津市大茂化學試劑廠；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：天津市瑞金特化學品有限公司；溴化噻唑藍四氮唑：普洛麥格生物科技有限公司；二甲基亞砜、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美國 Sigma；胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、DMEM 培養液：美國Gibco；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-10（Interleukinin-10，IL-10）試劑盒：武漢博士德生物園工程有限公司。

1.3 五味子總木脂素類化合物提取純化方法

取干燥的五味子粉碎成粗粉，過40 目篩，晾干，稱重。采用8 倍量95%乙醇回流提取2 次，每次提取1 h。合并兩次提取液，抽濾，將濾液利用旋轉蒸發濃縮，回收乙醇，加入適量蒸餾水制成濃度為0.15 g/mL 五味子總木脂素提取液。以HPD100 大孔吸附樹脂純化北五味子總木脂素類化合物，上樣量為7 BV，吸附流速和洗脫流速均控制在2 BV/h，徑高比為1∶6，洗脫溶劑為95%乙醇，洗脫量為11 BV，洗脫液利用旋轉蒸發濃縮，回收乙醇后冷凍干燥得固體粉末，即為五味子總木脂素類化合物。

1.4 五味子總木脂素類化合物樣品濃度測定

LC-20AT 型高效液相色譜系統，色譜柱為Diamonsil C18（5 μm，250 mm× 4.6 mm），柱溫 30℃，進樣量10 μL，體積流量1.00 mL/min，檢測波長為254 nm，流動相為 A（乙腈）-B（水），梯度洗脫程序為：0～10 min，20 %～60 % A；10 min～15 min，60 %～61 % A；15 min～20 min，61 %～62 % A；20 min～25 min，62 %～63 % A；25 min～30 min，63 %～64 % A；30 min～35 min，64 %～65 %A；35 min～40 min，65%～70%A；40 min～45 min，70%～75%A；45 min～55 min，75%～80%A。

精密稱取五味子醇甲、醇乙、酯甲、甲素、乙素對照品適量，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成含五味子醇甲濃度為0.1 mg/mL、醇乙濃度為0.05 mg/mL、酯甲濃度為0.05 mg/mL、甲素濃度為0.05 mg/mL、乙素濃度為0.05 mg/mL 的對照品混合溶液，備用。精密吸取五味子對照品混合溶液適量，配置成系列對照品溶液，以質量濃度（X）-峰面積（Y）進行線性回歸，得到5種木脂素對照品的標準曲線。精密吸取五味子總木脂素類化合物樣品溶液置于25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，經有機濾膜（0.45 μm）過濾后測定濃度。

1.5 抗氧化活性的研究

1.5.1 樣品溶液的制備

精密稱定提取純化后的五味子總木脂素類化合物凍干粉末適量，分別配制成濃度為0.05、0.1、0.2 mg/mL的樣品溶液各1 mL；精密稱取VC對照品1 mg，配制成濃度為0.2 mg/mL 的對照品溶液。

1.5.2 總抗氧化能力的測定

按照T-AOC 試劑盒的總抗氧化能力測定操作步驟進行測定，分別配制樣品管、對照管、VC對照管的待測溶液。采用紫外分光光度法，用蒸餾水調零，在520 nm 處測定各溶液吸光度值，并與同等濃度的VC對照品進行對照[8]。

式中：ODT為測定 OD 值；ODC為對照 OD 值。

1.5.3 對超氧陰離子自由基清除作用的考察

分別設定空白管、對照管、VC對照管和濃度分別為 0.2、0.1、0.05 mg/mL 的高、中、低濃度樣品組?？瞻坠芎蛯φ展芫尤? mL 蒸餾水，VC對照管加入4 mL已知濃度的VC對照品溶液，樣品組分別加入各自濃度樣品溶液4 mL。再向各管中加入0.1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 [Tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-Hcl]緩沖溶液（pH=8.2）4.5 mL，放入溫度為25℃的水浴鍋中傳溫20 min，除空白管外其余各管分別加入0.5 mL 3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，空白管以同體積蒸餾水代替，振搖后馬上在320 nm 處測定吸光度值，調零用空白管，每30 s 測一次，4 min 時停止。將所得數據橫坐標用t 表示，縱坐標用An 表示做回歸方程，得到的直線斜率Vx 即為反應速率[9-10]。

式中：V對照為鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min；V樣品為鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min；V對照回歸方程為Y=0.061 4x+0.056 4。

1.6 抗炎活性的研究

1.6.1 炎癥細胞模型的建立

首先利用MTT 法確定最大給藥濃度，將RAW264.7 細胞按 1×105/mL，200 μL/孔接種于 96 孔板中，接種細胞總數為2×104個/孔，置于CO2培養箱中，溫度37℃，CO2濃度5%，培養48 h，棄去細胞培養液，加入含有不同終濃度的含藥（總木脂素純化物、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素）DMEM 培養液 200 μL，空白組只加 DMEM 200 μL，各組均設置5個復孔，培養2.5 h，棄去細胞培養液，每孔加 1.0 mg/mL 的 MTT 100 μL 培養 4 h，棄去 MTT，每孔加 DMSO100 μL 振搖 20 min，在 570 nm 處測定吸光度值，計算抑制率。

抑制率 IC/%=（1-OD實驗組）/OD空白組×100

根據抑制率〉98%的藥物濃度為安全給藥劑量，再按照3×105個/mL 將細胞接種于六孔板中，每孔加入2 mL 培養基培養48 h，鏡下觀察細胞90 %融合，分別建立正常組（加入DMEM 培養液100 μL）、LPS組（加入含終濃度為10 μg/mL LPS 的DMEM 培養液100 μL）和藥物組（分別為含終濃度為2 mg/mL 純化物+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培養液 100 μL、含終濃度為 0.02 mg/mL 五味子醇甲+10 μg/mL LPS 的 DMEM培養液100 μL、含終濃度為0.02 mg/mL 五味子醇乙+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培養液 100 μL、含終濃度為0.02 mg/mL 五味子酯甲+10 μg/mLLPS 的 DMEM 培養液100μL、含終濃度為 0.02 mg/mL 五味子甲素+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培養液 100 μL、含終濃度為 0.02 mg/mL五味子乙素+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培養液 100 μL），置于CO2培養箱中培養24 h，收集細胞上清液，待測。

1.6.2 IL-10、TNF-α 和 NO 的測定

將待測樣品按照ELISA 試劑盒的說明進行加樣測定，每個樣品設置3個平行孔，加樣完畢后利用酶標儀檢測IL-10 和TNF-α 的濃度。標準物質濃度用橫坐標表示，標準物質平均OD 值用縱坐標表示，繪制標準曲線。待測樣品3 次測量的平均OD 值帶入標準曲線計算濃度。標準曲線方程分別為：Y=0.002 1x+0.148 6 R2=0.990 2（IL-10，濃度為 pg/mL）和 Y=0.002 2x+0.101 3 R2=0.997 4（TNF-α，濃度為 ng/mL）。

將待測樣品按照一氧化氮測試盒的說明配制所需的試劑，再按照操作表分別配制空白管、標準管和測定管（總木脂素純化物、五味子醇甲對照品、五味子醇乙對照品、五味子酯甲對照品、五味子甲素對照品、五味子乙素對照品）溶液，混勻配制完成的溶液，放在37℃恒溫箱中10 min，用UV1800 紫外光度計在光徑0.5 cm、波長550 nm 處用測定各管的吸光度值（蒸餾水調零）。

NO 含量/（μmol/L）=（測定OD 值-空白OD 值）/（標準 OD 值-空白 OD 值）×標準品濃度（100 μmol/L）×樣品測試前稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 五味子總木脂素類化合物濃度的測定

將供試品溶液按“1.4”色譜條件進行測定，得色譜圖見圖1，與對照品混合溶液色譜圖對照，確定5個色譜峰見表1。5種木脂素對照品的標準曲線見表2。

圖1 供試品高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography（HPLC）diagram of trial

表1 高效液相色譜法鑒定北味子中木脂素類成分Table 1 Identification of lignans in Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.by HPLC

表2 5種木脂素對照品回歸方程Table 2 Five lignans reference substance regression equation

由表2可知5種成分線性關系在各自濃度范圍內均良好。五味子總木脂素類化合物樣品溶液中5種木脂素成分含量總和為56%，說明經大孔吸附樹脂純化后，總木脂素純度較高，為接下來的研究奠定了物質基礎。

2.2 抗氧化活性的研究

2.2.1 總抗氧化能力的測定

按照總抗氧化能力試劑盒的操作方法進行測定，結果見表3。

表3 總抗氧化能力測定結果Table 3 Total antioxidant capacity test results

由表3結果可知，北五味子總木脂的總抗氧化能力隨著濃度的增加而呈現上升的趨勢；與同等濃度的VC對照品相比，北五味子總木脂素類成分的總抗氧化能力是VC的1/7 左右，說明五味子中總木脂素成分總抗氧化能力較好。

2.2.2 對超氧陰離子自由基清除作用的考察

超氧陰離子自由基作為生物體所產生的一種自由基，與多種疾病的發病機制有關，測定中藥提取物對超氧陰離子的清除效果，可提示其抗氧化作用及對疾病治療機理[11-12]。按照1.5.3 方法測定不同濃度北五味子總木脂素的超氧陰離子自由基清除，結果見表4。

表4 超氧陰離子自由基清除率測定結果Table 4 Superoxide anion free radical scavenging rate measurement result

由表4可知，北五味子總木脂素清除超氧陰離子自由基的強度隨著濃度的增加而逐漸增強；與同等濃度的VC對照品相比，北五味子總木脂素類成分清除超氧陰離子自由基的強度是VC的1/6 左右，說明其能夠較好的清除超氧陰離子自由基。

2.3 抗炎活性的研究

MTT 比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法，其原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，甲瓚可被二甲基亞砜溶解，用酶標儀在570 nm 波長處測定其光吸收值可間接反映活細胞數量，該法可用于細胞毒性試驗，反映中藥提取物對細胞的毒性作用，確定最大給藥劑量。按照1.6.1 方法進行細胞毒試驗，結果見表5。

表5 MTT 試驗結果Table 5 MTT test results

續表5 MTT 試驗結果Continue table 5 MTT test results

由表5中數據可知，提取純化后總木脂素純化物在含量低于2 mg/mL 時對細胞無毒性。各對照品溶液在含量低于0.02 mg/mL 時對細胞也是無毒性的，但隨著他們各自含量的增高，各對照品溶液就會對細胞產生一定的毒性作用，其中五味子對照品甲素和五味子對照品醇甲隨著濃度的增加對細胞產生的毒性增加顯著。而五味子對照品醇乙、五味子對照品酯甲和五味子對照品乙素濃度升高對細胞產生的毒性增加不大，因此選用0.02 mg/mL 濃度的5種對照品來進行抗炎試驗研究。

小鼠單核巨噬細胞Raw264.7可分泌多種炎癥相關因子參與機體免疫應答，按照1.6.2 方法利用Elisa法測定北五味子總木脂素類成分及5種五味子木脂素對照品對小鼠單核巨噬細胞分泌相關因子的影響，結果見表6。

表6 總木脂素對小鼠巨噬細胞分泌IL-10、TNF-α 和NO 的影響Table 6 Effects of total lignans on IL-10，TNF-α and NO secretion by mouse macrophages

IL-10 主要由單核巨噬細胞產生，為炎癥抑制因子。由表6中數據可知，5種對照品溶液均可促進IL-10 的分泌，其中甲素作用最強、醇乙作用較差，提取純化后的五味子總木脂素純化物可使IL-10 含量顯著升高。TNF-α 是腫瘤壞死因子的一種，單核細胞和巨噬細胞是產生TNF-α 的主要細胞，為炎癥促進因子。5種對照品對LPS 作用后的小鼠巨噬細胞分泌TNF-α均有一定的抑制效果，其中五醇乙作用最強、甲素作用較差，提取純化后的總木脂素純化物對TNF-α 的抑制效果較好。硝酸還原酶催化硝酸離子還原成亞硝酸離子的反應稱為硝酸還原酶法，它是一種氧化還原酶。5種對照品溶液和五味子總木脂素純化物都可使由LPS 誘導的細胞產生的NO 濃度降低，其中酯甲作用最強、而醇乙作用較差，提取純化后的總木脂素純化物效果較好。

綜合上述3種因子的測定結果，說明北五味子總木脂素具有一定的抗炎活性，優于部分木脂素對照品，并且，不同的木脂素類成分在發揮抗炎方面發揮著不同的作用[13-16]。

3 結論

油脂自動氧化是自由基鏈式反應，該反應過程中可產生多種氧自由基，這些氧自由基具有很高的反應活性，能與人體內脂質、蛋白質、DNA 等大分子物質結合，破壞其結構和功能，導致人體衰老，并引發癌癥、動脈粥樣硬化和白內障等多種疾??；同時油脂氧化過程中產生的過氧化脂質，不僅可導致食品的營養及感官特性發生劣變，而且可以誘發致突變物質的產生，同時，成為人體衰老的主要因素就是某些自由基的產生和存在。該文采用總抗氧化能力和超氧陰離子自由基清除率兩種方法對北五味子中總木脂素的抗氧化活性進行考察，測定的方法簡便、快速且穩定性好。試驗從整體和部分分別考察，使結果更加客觀明了，從試驗數據可以看出，北五味子總木脂素達到一定濃度時就可發揮一定的抗氧化活性，本試驗對日后研發清除超氧陰離子自由基的天然藥抗氧化藥物奠定了基礎。中藥對人體的傷害小，不易產生抗藥性，并且來源廣泛，本文通過ELISA 試劑盒和一氧化氮試劑盒對北五味子總木脂素進行了抗炎活性的研究。結果顯示純化后的五味子總木脂素和5種對照品對小鼠巨噬細胞分泌TNF-α、IL-10 和NO 都具有一定的影響，表明總木脂素具有一定的抗炎作用，但是試驗只是對總木脂素的抗炎作用進行了一些細胞層面的研究，在醫學上并沒有給出明確的防治意義，需要在今后的研究中結合動物實驗及其他相關試驗做更深一步的討論。北五味子中總木脂素具有良好的抗氧化、抗炎等作用，有研究表明五味子果梗和葉片中有與五味子果實相同的木脂素類成分，可作為五味子果實的良好替代品。若能將五味子各個部分都加以良好應用，運用精密的提取純化工藝，在以后的生產中可以得到大批量含有藥理活性成分的原料，則可在中藥研發和保健品生產研發上做出巨大貢獻。