睡菜提取物對小鼠急性毒性及鎮靜催眠活性研究

林芳，陳靜文，張志麒，劉呈雄，陳劍鋒，鄒坤，程凡，*

（1.三峽大學 生物與制藥學院天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.神農架國家公園管理局，湖北 神農架林區 442400）

睡眠，是高等脊椎動物周期出現的一種自發的和可逆的靜息狀態，對人類身體健康極為重要。隨著社會生活節奏的加快，人們生活壓力的增加使得越來越多的人出現睡眠問題。目前市面上的的鎮靜催眠藥主要為巴比妥類和苯二氮卓類藥物，但是該類西藥治療極易伴隨有困倦乏力，頭暈嗜睡等不良反應，長期服用可能出現成癮性，突然停藥會有戒斷反應[1]。而傳統安神中藥鎮靜安神效果明顯，副作用小的優點，目前市面上即可用作藥品又可作為食品的安神類藥材主要有酸棗仁，百合等。

睡菜（Menyanthes trifoliate L.）為龍膽科睡菜屬多年生沼生草本，又名“醉草、綽菜、瞑菜”，以全草或葉入藥，具有“食之令人思睡”的神奇功效?！侗狈匠Ｓ弥胁菟幨謨浴吩唬核宋陡饰⒖?，性溫，無毒，能健脾消食，養心安神[2-3]。民間部分地區有春夏季節采摘睡菜做泡菜的習慣，食用后使人思睡，睡菜也可作為啤酒的苦味劑，目前民間部分地區已將其作為安神類食物使用，但目前筆者尚未見對睡菜的鎮靜催眠活性和急性毒性活性的評價報道。

現有研究表明，睡菜所屬的龍膽科植物中含有的化合物結構類型豐富多樣，主要含有環烯醚萜類、黃酮類、三萜類、揮發油類以及其他類型的化合物[4-5]，根據不同的結構特征分布于不同的極性部位，在課題前期已經對睡菜總提取物鎮靜催眠活性進行了評價的基礎上，為進一步驗證其藥理作用，為將睡菜作為安神保健類食物開發的后續研究提供理論依據，本課題初步對睡菜提取物灌胃小鼠急性毒性和鎮靜催眠活性部位進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物：昆明種小鼠（SPF 級），（20±2）g，雌雄各半，由三峽大學實驗動物中心提供，實驗單位使用許可證編號：SYXK（鄂）2017-0061；許可證號：SYXK（鄂）2017-0012，動物質量合格證編號NO.42010200001498；NO.42010200001499。分籠飼養，自由飲水和攝食，適應環境1 周后開始實驗，控制室溫為（22±2）℃，濕度為（55±15）%。

睡菜樣品2016年8 月采集自湖北省神農架大九湖，經三峽大學生物與制藥學院王玉兵博士鑒定為龍膽科睡菜屬植物睡菜（Menyanthes trifoliate L.）的全草。干燥、粉碎后的睡菜全草經95%乙醇回流提取，濃縮后浸膏用水懸浮，分極性萃取得到石油醚部位、乙酸乙脂部位、正丁醇部位和水部位。

戊巴比妥鈉鹽（批號：F0749）：山東西亞化學工業有限公司；地西泮片（批號：H1020898）：北京益民藥業有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YLS-1A 型多功能小鼠自主活動記錄儀：上海欣軟信息科技有限公司；Gzx-9240MBE 型數顯鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；N-1001 型旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 睡菜提取物和萃取部位制備

睡菜樣品40℃恒溫干燥，經藥物粉碎機粉碎后過篩，得到原藥材粉末。加入4 L 的95%乙醇，常壓回流提取3 次，每次2 h。提取液過濾后合并，50℃減壓濃縮得到總浸膏，浸膏提取率約10%?？偨嘤盟鶆蚧鞈?，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮，真空干燥后得到各部位提取物，各部位提取率約為25%。實驗時使用質量分數為0.5%的羥甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）溶液進行配置。

1.3.2 睡菜總提物小鼠急性毒性實驗

1.3.2.1 小鼠急性毒性預實驗

小鼠30只，雌雄各半，隨機分組稱重，每組6只，分為5組。設定劑量等比級數為1∶0.7，睡菜總提取物劑量分別為 2.4、3.43、4.9、7、10 g/kg。按不同劑量配制相應濃度的藥液，最大給藥濃度10 g/kg，各組給藥體積均為0.4 mL/10 g，觀察并記錄小鼠的死亡情況。

1.3.2.2 小鼠急性毒性最大耐受量實驗

經預實驗，睡菜總提取物口服給與最大給藥容積以及藥物能溶解的最大給藥劑量，仍未有小鼠死亡，因此進行睡菜總提取物小鼠急性毒性最大耐受量實驗。

取小鼠32只，雌雄各半，隨機分組稱重，每組16只，分為兩組即給藥組和空白對照組。實驗前禁食不禁水12 h，給藥組單次灌胃給與最大給藥濃度10 g/kg，最大灌胃體積0.4 mL/10 g；空白對照組給與相應體積的0.5%的CMC-Na 溶液。給予藥物后每天至少觀察記錄2 次小鼠狀態，觀察指標包括有小鼠外觀體征、行為活動、呼吸、糞便性狀等。觀察期間保證小鼠喂養條件不變，發現死亡小鼠記錄死亡時間并及時進行解剖，連續1 周每天定時對小鼠進行觀察并記錄小鼠體重。1 周后將所有小鼠處死解剖[6-8]。

1.3.3 小鼠自主活動影響實驗

根據《中華本草》記載的睡菜用藥：睡菜，內服：煎湯，10 g～15 g[9]。參考《藥理實驗方法學》，人和小鼠按體表面積折算的等效劑量比值為0.002 6[10]。實驗過程中，依據人的劑量為15 g，換算成小鼠劑量，睡菜小鼠給藥的生藥量為 1.95 g/kg（15 g/kg×0.002 6/0.02 kg），浸膏提取率10%，即總浸膏給藥量為0.195 g/kg，各部位萃取率均約為25%，即部位給藥低劑量為臨床劑量50 mg/kg，部位給藥高劑量組設為臨床劑量的4 倍，200 mg/kg。

小鼠100只，每組10只，隨機分為10組，即空白組、陽性藥組（地西泮0.25 mg/kg）、石油醚部位組（50、200 mg/kg）、乙酸乙酯部位組（50、200 mg/kg）、正丁醇部位組（50、200 mg/kg）、水部位組（50、200 mg/kg）。按體重連續灌胃給藥7 d，空白組灌胃相應體積的0.5%CMC-Na，末次灌胃給藥前，禁食不禁水12 h，末次灌胃給藥60 min 后，將各組小鼠置于自主活動儀中，適應5 min 后，開始測定各組小鼠的自主活動情況，記錄10 min 內小鼠的自主活動次數。

1.3.4 協同閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠入睡率實驗

戊巴比妥鈉劑量預實驗，取30只小鼠，隨機分為5組，每組6只，分別腹腔注射戊巴比妥鈉，劑量為20、25、30、40、45 mg/kg。記錄 30 min 內小鼠的入睡率，保持90%動物不睡的最大劑量即為閾下劑量，而閾上劑量為保持所有動物全部入睡的最小劑量。

實驗分組如同小鼠自主活動實驗分組，按體重連續灌胃給藥7 d，空白組灌胃相應體積的0.5%CMCNa，末次灌胃給藥前，禁食不禁水12 h。根據戊巴比妥鈉劑量預實驗，選定腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾下劑量為25 mg/kg，可保持90%小鼠不睡，末次灌胃給藥60 min 后，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾下劑量25 mg/kg，觀察小鼠，60 s 翻正反射消失為發生睡眠，記錄30 min內翻正反射消失的動物只數，計算睡眠百分率。

睡眠百分率/%=入睡動物只數/動物總只數×100

1.3.5 協同閾上劑量戊巴比妥鈉小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間實驗

實驗分組如同小鼠自主活動實驗分組，按體重連續灌胃給藥7 d，末次灌胃給藥前，禁食不禁水12 h，空白組灌胃相應體積的0.5%CMC-Na。根據戊巴比妥鈉劑量預實驗，當戊巴比妥鈉劑量為40 mg/kg 時，小鼠并未全部入睡，劑量為45 mg/kg 時小鼠全部入睡，因此選定腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾上劑量為45 mg/kg，末次灌胃給藥60 min 后，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾上劑量45 mg/kg，觀察小鼠，記錄小鼠注射后到翻正反射消失的時間為入睡潛伏期，翻正反射消失到翻正反射恢復的時間為小鼠睡眠時間[11-14]。

1.3.6 統計方法

采用統計學軟件SPSS 25.0 軟件對實驗數據分析處理。不同劑量組灌胃給藥后，引起的給藥組和對照組之間的差異顯著性采用單因素方差分析法進行多重比較，閾下劑量戊巴比妥鈉實驗數據采用Fisher 精確檢驗分析。數據以表示，以P〈0.05 為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 睡菜提取物小鼠急性毒性

最大耐受量法評價睡菜提取物小鼠急性毒性，一般行為學觀察，與空白對照組相比，給藥當天給藥組出現部分小鼠自主活動減少，部分小鼠出現昏睡，但是易警醒而恢復正?；顒?。1 h 后小鼠自主活動逐步恢復正常。睡菜提取物對小鼠體重的影響結果見表1所示。

表1 睡菜提取物對小鼠體重的影響（，n=16）Table 1 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on weight gain in mice（，n=16）

表1 睡菜提取物對小鼠體重的影響（，n=16）Table 1 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on weight gain in mice（，n=16）

注：-表示灌胃同體積CMC-Na 溶液。

分組 劑量/（g/kg）給藥前/g給藥當天/g給藥次日/g 1 周后/g空白組 - 19.7±0.8 22.0±0.9 22.5±1.2 30.4±1.7睡菜提取物組 10 18.9±0.9 21.7±1.2 21.4±1.6 28.8±2.9

由表1可知，與空白對照組相比，給藥當日小鼠進食量略微減少，體重降低，但毛色光滑，糞便，尿液，活動未見明顯異常；第2 天小鼠活動，攝食，體重增長基本恢復正常，且1 周內無動物死亡。1 周后動物體重均有增加，兩組動物體重差異并不明顯。觀察期結束后對所有小鼠進行解剖，肉眼觀察給藥組動物的主要臟器，與空白對照組相比無明顯差異。

2.2 睡菜提取物對小鼠自主活動的影響

睡菜提取物對小鼠自主活動的影響結果如表2所示。

表2 睡菜提取物對小鼠自主活動的影響（，n=10）Table 2 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the autonomic activity（，n=10）

表2 睡菜提取物對小鼠自主活動的影響（，n=10）Table 2 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the autonomic activity（，n=10）

注：與空白組相比，*P〈0.05 有顯著差異。-表示灌胃同體積CMC-Na溶液。

組別劑量/（mg/kg）自主活動次數空白對照組 - 128.5±9.14地西泮組 0.25 72.2±9.46*石油醚高劑量組 200 128.1±9.81石油醚低劑量組 50 127.2±8.92乙酸乙酯高劑量組 200 76.7±7.96*乙酸乙酯低劑量組 50 85.6±9.12*正丁醇高劑量組 200 72.2±12.92*正丁醇低劑量組 50 78.1±7.43*水部位高劑量組 200 136±9.07水部位低劑量組 50 131.8±11.71

由表2可知，與空白對照組相比，睡菜提取物乙酸乙酯部位以及睡菜提取物正丁醇部位組的小鼠自主活動次數明顯減少，且具有統計學差異。而睡菜提取物石油醚部位以及睡菜提取物水部位組小鼠自主活動次數與空白對照組相比無明顯差異。

2.3 睡菜提取物對閾下劑量小鼠戊巴比妥鈉鎮靜催眠作用的影響

睡菜提取物對閾下劑量小鼠戊巴比妥鈉鎮靜催眠作用的影響結果如表3所示。

表3 睡菜提取物對小鼠入睡率（戊巴比妥鈉閾下劑量）的影響（n=10）Table 3 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the sleep rate in mice（n=10）

由表3可知，睡菜石油醚部位入睡率與空白組無明顯差異。睡菜提取物可增加閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠入睡率，且睡菜提取物的乙酸乙脂部位，正丁醇部位以及水部位均能一定程度上增加閾下劑量戊巴比妥鈉的小鼠入睡率。陽性藥物組入睡率為60%，乙酸乙酯高劑量組入睡率為60%，而正丁醇部位低劑量組入睡率為70%。乙酸乙酯部位和正丁醇部位戊巴比妥鈉閾下劑量鎮靜催眠作用明顯。

2.4 睡菜提取物對閾上劑量小鼠戊巴比妥鈉鎮靜催眠作用的影響

睡菜提取物對閾上劑量小鼠戊巴比妥鈉鎮靜催眠作用的影響結果如表4所示。

表4 睡菜提取物對小鼠睡眠潛伏期和入睡率（戊巴比妥鈉閾上劑量）的影響（，n=10）Table 4 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the latency of sleep and the sleep time of mice（，n=10）

表4 睡菜提取物對小鼠睡眠潛伏期和入睡率（戊巴比妥鈉閾上劑量）的影響（，n=10）Table 4 Effects of extract of Menyanthes trifoliate L.on the latency of sleep and the sleep time of mice（，n=10）

注：與空白組相比，*P〈0.05 有顯著差異。-表示灌胃同體積CMC-Na溶液。閾上劑量戊巴比妥鈉實驗數據采用Fisher 精確檢驗分析。

組別劑量/（mg/kg） 睡眠潛伏期/min 睡眠時間/min空白對照組 - 6.97±0.22 33.54±0.14地西泮組 0.25 4.01±0.18* 50.61±0.18*石油醚高劑量組 200 6.02±0.25 31.35±0.18石油醚低劑量組 50 6.01±0.26 32.78±1.39乙酸乙酯高劑量組 200 5.01±0.44 47.29±1.60*乙酸乙酯低劑量組 50 5.03±0.25 52.10±1.46*正丁醇高劑量組 200 3.3±0.31* 64.34±1.42*正丁醇低劑量組 50 4.05±0.18* 52.10±1.46*水部位高劑量組 200 6.06±0.24 37.32±0.95水部位低劑量組 50 5.95±0.18 36.08±1.01

由表4可知，與空白組相比，睡菜提取物石油醚部位、水部位的睡眠潛伏期和睡眠時間均無明顯差異；而正丁醇部位高劑量組，正丁醇部位低劑量組，乙酸乙脂部位高劑量組，乙酸乙脂部位低劑量組可明顯縮短戊巴比妥鈉閾上劑量小鼠睡眠潛伏期，延長睡眠時間。陽性藥物組深度睡眠時間（50.61±0.18）min，乙酸乙酯部位低劑量組深度睡眠時間（52.10±1.46）min，正丁醇部位高低劑量組深度睡眠時間分別為（52.10±1.46）min 和（64.34±1.42）min。結果顯示，乙酸乙酯部位和正丁醇部位戊巴比妥鈉閾上劑量鎮靜催眠活性明顯。

3 結論與討論

相關文獻古籍對睡菜毒性及其安神功效早已有記載[2-4]，但至今，對其毒理和藥理活性研究甚少。為明確睡菜的安全性和藥效，也為后續將睡菜作為安神保健食物正式開發利用，本課題對睡菜提取物的小鼠經口給藥急性毒性及其鎮靜催眠活性進行了研究。

實驗結果表明，睡菜提取物急性毒性的MTD 大于10 g/kg，證實睡菜提取物灌胃給藥的小鼠急性毒性較低，初步從現代醫學角度對睡菜的食用安全性進行了佐證。以地西泮作為陽性對照，行為學評價睡菜提取物鎮靜催眠活性，鎮靜催眠活性實驗結果顯示，睡菜提取物具有較好的鎮靜催眠活性，通過對活性部位的追蹤，初步確定其鎮靜催眠活性部位為乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

對龍膽科植物化學成分研究發現，龍膽科植物乙酸乙酯部位的主要化合物類型為三萜類化合物[15]和黃酮類化合物，而正丁醇部位主要為環烯醚萜苷類化合物以及黃酮苷類化合物[16]?，F有研究對這幾種化合物鎮靜催眠活性研究均有報道，如酸棗仁中的鎮靜催眠活性成分斯皮諾素[17]，合歡花中的主要鎮靜催眠活性成分槲皮素，槲皮苷等[18-19]，以及龍膽科植物中的獐牙菜苦苷都有中樞神經鎮靜作用[20]?，F有文獻報道與實驗研究結果相互佐證，睡菜乙酸乙酯部位和正丁醇部位的鎮靜催眠活性可能與這些類型化合物相關。

本課題為睡菜的食用安全性和藥理活性提供了一定的科學依據，也從現代醫學角度佐證了睡菜的功效及其在古代的應用，深化了中醫藥理論。睡菜具有毒性小且鎮靜催眠效果明顯的特點，本課題初步探究明確鎮靜催眠活性部位，在后續的研究中，將根據活性導向，進一步探索睡菜鎮靜催眠活性的藥效物質基礎，為將睡菜正式開發為安神保健食品打下基礎。