含糊精成分的銀耳提取物中的多糖含量的測定

丘燕，楊潞芳

（通標標準技術服務有限公司廣州分公司，廣東 廣州 510663）

多糖是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的碳水化合物，包括活性多糖和膳食纖維兩大類[1-2]?；钚远嗵菍Ｖ妇哂心撤N特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和殼聚糖等。真菌多糖有香菇多糖、銀耳多糖、金針菇多糖、云芝多糖、靈芝多糖、黑木耳多糖、蟲草多糖、真菌豬苓等；植物多糖有茶多糖、魔芋葡甘露聚糖、銀杏（葉）多糖等。這類多糖具有復雜的、多方面的生理活性和功能，因而越來越引起人們的關注[3-4]。

在多糖工業生產中，常需對多糖的含量進行測定和監控，由于多糖的種類繁多，含量和存在形式也多變，因此選擇適當的、操作簡單的多糖分析方法十分重要。多糖常見的檢測定方法有苯酚-硫酸分光光度測定法、蒽酮-硫酸分光光度測定法、堿性酒石酸銅滴定測定法[5-6]等。苯酚-硫酸法原理是多糖在濃硫酸作用下水解成單糖并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，以葡萄糖標準品，然后用紫外分光光度計在490 nm 處測定吸光值與葡萄糖濃度的線性關系，進而對樣品定量。該法具有操作簡單、快速、顯色后穩定性好、測定用試劑便宜、設備簡單等優點，而被廣泛應用[7]。

銀耳營養豐富，食味鮮美，銀耳多糖是銀耳中的主要活性物質。銀耳多糖主要生理功能有提高免疫調節能力、輔助抑制腫瘤作用、延緩衰老作用、調節血糖血脂、預防血栓、抗輻射、保護胃粘膜等[8]。銀耳多糖以其獨特的生物學功能和良好的食用安全性，近年來在天然功能性食品添加劑、保健品、化妝品等領域嶄露頭角[9-10]。不過現在市面上的銀耳多糖或銀耳提取物產品，很多都有添加糊精成分，在測定中經常被誤判為多糖而影響多糖的定量。如何確認銀耳多糖或銀耳提取物產品中的多糖含量成為一個重要的課題。本文就苯酚-硫酸法測定含糊精成分的銀耳提取物中的多糖含量進行研究驗證，為市場中摻有糊精的銀耳提取物中的多糖含量的準確測定提供一種操作簡單、準確測定的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；5804R 離心機：Eppendorf；DK-S26 雙列六孔電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；MM-2 快速漩渦振蕩器：姜堰市沈高康健生器具廠。

1.2 試劑

無水葡萄糖對照品、葡聚糖對照品（45 萬～65 萬分子量）、葡聚糖對照品（4 萬分子量）：中國藥品生物制品檢定所；硫酸、無水乙醇、苯酚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；糖化酶（10 萬U/mL）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 其他材料

銀耳提取物：西安雨諾生物工程有限公司；糊精：西安錦源生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 標準溶液的配制

準確稱取干燥恒重的分析純葡萄糖對照品0.500 0 g加水溶解并定容至50 mL，此溶液1 mL 含10 mg 葡萄糖，用前稀釋100 倍為使用液（0.1 mg/mL）。

1.4.2 5%苯酚溶液配制

稱取精制苯酚5.0 g，加水溶解并定容至100 mL，混勻。溶液置于冰箱中可保存1個月。

1.4.3 標準曲線的制備

準確吸取葡萄糖標準使用液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.00 mL（相當于葡萄糖 0、10、20、40、60、80、100 μg），分別置于25 mL 比色管中，補加水至2 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，在漩渦混合器上混勻，小心緩慢地滴加濃硫酸10 mL，在漩渦混合器上小心混勻，置于沸水浴中2 min，冷卻至（約26℃），用分光光度計在485 nm波長處，1 cm 比色皿測定吸光度。

1.4.4 多糖含量的測定

稱取銀耳提取物0.80 g+糊精0.20 g 置于200 mL容量瓶，加水80 mL 左右，于沸水浴中加熱1 h，冷卻至室溫定容混勻后過濾，取50 mL 濾液置于100 mL 錐形瓶中，加入1 mL 糖化酶，置于60℃水浴酶解60 min取出（用碘液檢驗是否水解完全），與電爐上小心加熱至沸（滅酶）冷卻，定容至100 mL，過濾，取濾液5 mL置于50 mL 離心管中，加入20 mL 無水乙醇，混勻，置于 4℃冰箱 4 h 以上，以 4 000 r/min 離心 5 min，棄去上清液，殘渣用80%乙醇溶液10 mL 洗滌3 次，殘渣用水溶解并定容至25 mL，搖勻。準確吸取樣液1 mL置于25 mL 比色管中，補加水至2 mL，按標準曲線的步驟于485 nm 處測定吸光度，根據標準曲線求得樣品多糖含量[11-13]。

1.5 多糖的計算

式中：X 為樣品中多糖含量，mg/100 g；m1為樣品測定液中葡萄糖的質量，mg；m2為樣品質量，g；N 為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 測定方法的優化

2.1.1 專屬性

考慮到用糖化酶去除糊精干擾的步驟，用實驗室用水、實驗室用水+糊精（下稱20%糊精水溶液）作為樣品空白，考察方法的專屬性；同時用實驗室用水作為樣品空白，按方法進行測定（不使用糖化酶步驟），考察糖化酶帶來的影響；分別采集吸光度數據，結果如表1所示。

表1 專屬性試驗結果Table 1 Specific experimental results

從表1 數據分析可知，樣品為實驗室用水和20%糊精水溶液時，吸光度均在0.03 附近，證明此測試過程試劑會帶入干擾；而試驗過程未使用糖化酶試劑的測定吸光度的結果為0，表明在測試過程中糖化酶試劑會給測定帶來一定的影響，使得測試結果偏高[14-15]。

2.1.2 糖化酶的使用量考察

考慮到不同的銀耳提取物摻雜糊精的含量不一樣，評估糊精的含量和糖化酶使用量的情況，本方法中糖化酶使用量為0.1 mL，考察不同糊精含量時糖化酶是否能完全地將糊精干擾去除，所以分別配制20%、40%、60%、80%糊精水溶液，按1.4.4 進行測定，分別采集吸光度，結果如表2。

表2 糖化酶的使用量考察Table 2 Estimated usage of glucoamylase

表1 兩組數據的相對標準偏差為0.80%，無明顯差異，證明樣品中的糊精的干擾已被糖化酶去除，不會影響最終多糖的含量，專屬性良好；表2中4組數據相對標準偏差為0.000 7%，無明顯差異，證明不同含量的糊精樣品，用糖化酶進行處理后帶入的影響穩定，所以確定在后續的方法中，糖化酶的加入量為0.1 mL，且增加方法空白以扣除糖化酶帶來的空白影響[14-15]。

2.2 精密度考察

實驗室1 稱取6 份樣本（銀耳提取物0.80 g+糊精0.20 g）按以上確定的方法進行多糖的測定，以考察方法的重復性；同時安排在另一實驗室（實驗室2）另一位測試工程師同樣稱取6 份樣本（銀耳提取物0.80 g+糊精0.20 g）按以上確定的方法進行多糖的測定，以考察方法的重現性，測定結果如表3 示。

表3 精密度試驗結果Table 3 Precision experimental results

由表3 精密度試驗結果數據看出，兩個實驗室6組平行試驗的相對標準偏差分別為0.27%和0.18%，此方法在同一實驗室內的重復性良好；兩個實驗室的測定平均值分別為15.54%和15.08%，相對標準偏差為3%，此方法在不同實驗室間的重現性良好。因此此方法的精密度達到分析方法的要求，精密度良好[16-18]。

2.3 準確度考察

考慮到多糖的分子量從幾萬到幾千萬，而該方法中所使用的標準品是葡萄糖，所以本方法的準確度試驗除了考察用葡萄糖進行加標外，還增加用不同分子量葡聚糖的加標。

2.3.1 葡萄糖加標

精確稱取樣本（0.8 g 銀耳提取物+0.20 g 糊精）于200 mL 容量瓶，平行稱取6 份，制得供試品溶液。按試樣含量的100 %進行加標，再準確量取供試品溶液1.00 mL，加水補至2.0 mL，按照1.4.3 步驟測定吸光度，從標準曲線上讀出補水后供試品溶液中多糖的濃度，計算得到加標回收結果。進行6 次平行試驗，試驗數據如表4所示。

2.3.2 不同分子量葡聚糖加標

對樣品從稱樣開始進行100%的葡聚糖（分子量分別為4 萬和45 萬～65 萬）加標，分別稱取6個平行樣，制得供試樣品溶液，按照1.4.4 步驟測定吸光度，從標準曲線上讀出補水后供試品溶液中多糖的濃度，計算得到加標回收結果，試驗結果如表4所示。

表4 加標回收結果Table 4 Recovery results

由表4 加標回收結果數據看出，葡萄糖加標回收率在99.52%～101.59%之間，葡聚糖（4 萬）加標試驗回收率在99.56%～101.68%之間，葡聚糖（45 萬～65 萬）加標試驗回收率在99.83 %～101.46 %之間，均落在98%～102%之間，回收良好，符合分析方法的要求，證明該方法準確度良好[16-18]。

2.4 線性和范圍考察

精密量取無水葡萄糖標準使用液0、0.08、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL（相當于正常的標準曲線上下各延伸20%的濃度點）分別置于25 mL 比色管中，準確補水至2 mL（分別相當于葡萄糖含量為0、8、10、20、40、60、80、100、120 μg 的供試標準溶液），精確加入5 %苯酚溶液1.0 mL，混勻；精密加入硫酸10 mL，搖勻，置水?。?8℃～100℃）中煮沸 2 min，取出，冷卻至（約26℃），用分光光度計在485 nm 波長處以試劑空白溶液為參比，1 cm 比色皿中測定吸光度值。以無水葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程如圖1所示。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

由圖 1可知，無水葡萄糖在濃度 8 μg～120 μg 范圍內，吸光度與葡萄糖濃度成良好線性關系，標準曲線回歸方程：y=0.004 21x-0.012 61，R2=0.999 4，相關系數R2大于0.995 0，適用于定量分析。

2.5 耐用性考察

針對測試過程中容易產生變化的某些重要影響因素進行試驗，評估方法的耐用性。具體試驗的因素包括：測試溶液酶解溫度分別為 50、55、58、60℃、酶解時間分別為 50、60、65 min，煮沸時間分別為 2、5、10 min，沉淀多糖時間分別為 4、8 h、〉12 h（放置過夜），其他條件固定，分別進行3 平行試驗，多糖測定結果如表5所示。

從表5 耐用性試驗結果看出，酶解溫度偏低，酶的活力會產生變化，以致測試結果偏低，所以測試時，必須嚴格控制酶解溫度；酶解時間在50 min～65 min 之間時，多糖的測定結果的相對標準偏差為0.15%；煮沸時間在2 min～10 min 之間時，多糖的測定結果的相對標準偏差為0.12%；沉淀多糖時間在大于4 h 時，多糖的測定結果的相對標準偏差為0.08%；酶解時間、煮沸時間、沉淀多糖時間在一定的波動范圍內，多糖的測定結果無明顯變化，該方法耐用性良好。

3 結論

苯酚-硫酸法測定多糖所用試劑糖化酶會在測定過程中帶入干擾，嚴重影響定量結果，使定量結果偏高。本試驗通過專屬性和糖化酶使用量的考察，確定干擾的程度，優化測定方法為增加方法空白的測定并在計算時扣除。對優化后方法進行精密度、準確度、線性和范圍、耐用性進行考察研究，其中精密度中不同實驗室測試結果相對標準偏差為3%，準確度中加標回收率在98%～102%之間，相關系數R2大于0.995 0，耐用性良好，所建方法符合分析要求，該測定方法有使用設備簡單、操作方便、試劑便宜等優點，為市場中摻有糊精的銀耳提取物中的多糖含量的準確測定提供了一種有效方法[19-20]。