腫瘤相關成纖維細胞中G蛋白偶聯雌激素受體胞漿轉位介導的旁分泌對乳腺癌細胞生長的影響

余騰驊，涂剛，彭美茜，孫可馨，柳滿然

（1.江西省腫瘤醫院 乳腺腫瘤外科，江西 南昌 330029；2.重慶醫科大學附屬第一醫院 內分泌乳腺外科，重慶400016；3.重慶醫科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016）

腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）旁分泌多種生長因子、蛋白水解酶等促進乳腺癌細胞生長、侵襲、轉移及多種臨床藥物耐受[1-4]。值得注意的是，乳腺癌微環境中約80%的正常成纖維細胞被激活為CAFs，是腫瘤組織中最主要的成分之一[5]。G蛋白偶聯雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）被公認為第三種獨立作用的雌激素受體，在多種正常細胞與惡性腫瘤細胞系中均證實17-β雌二醇（E2）及GPER特異性激動劑G1均可活化GPER并介導下游雌激素效應[6-13]，是預測乳腺癌患者臨床預后、內分泌治療獲得性耐藥及靶向治療的有效生物學指標。研究團隊在前期實驗中發現，GPER介導CAFs中芳香化酶基因CYP19A1與糖酵解基因PDK4高轉錄活性，可能是促進腫瘤組織中局部雌激素水平增加與酸性微環境的關鍵因素，從而在乳腺癌細胞增殖、轉移及藥物耐受中扮演始動作用[11-13]，GPER或是介導CAFs與腫瘤細胞之間“交叉對話”進而促進乳腺癌進展的重要媒介。

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGFs）是一類能調節細胞增殖、分化的多肽家族，在機體許多組織和器官內均有不同程度的分布?，F有研究[14-16]表明，成纖維細胞生長因子2（FGF2）的過量表達與腫瘤發生發展密切相關，不僅參與腫瘤血管新生，還間接調控腫瘤細胞的生長及侵襲轉移能力。然而，乳腺癌微環境CAFs中GPER介導的生長因子調節作用研究較少，其與FGF2的調控關系及下游生物學作用更是研究“盲點”。因此，本研究擬利用E2、G1及FGF2中和抗體[17]等小分子化合物首次探討共培養條件下乳腺癌微環境CAFs中細胞漿GPER活化對FGF2的表達調控作用及其旁分泌對腫瘤細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

MCF-7細胞系（ER+）和MDA-MB-468細胞系（ER-）購自中國科學院上海細胞庫，研究團隊前期已構建體外穩定培養的永生化CAFs細胞株[11-13]，高糖DMEM培養基（Gibco公司），南美胎牛血清（Gibco公司)。E2與GPER特異性激動劑G1（Sigma公司），FGF2中和抗體（Millipore公司），DAPI與FITC標記山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋公司），FGF2 ELISA試劑盒（Rapidbio公司），總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司），熒光定量PCR試劑盒（BioTeKe公司），GPER抗體（Abcam公司），CCK-8試劑盒（碧云天公司）。流式細胞儀（FACS Callur），CO2培養箱（Thermo scientific），多功能酶標儀（Sunrise），MiniOpticon實時PCR儀和穩壓DNA電泳儀（BioRad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養MCF-7、MDA-MB-468 及 CAFs細胞均培養于10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，37℃、5% CO2培養箱內生長，隔日換液，待細胞密度生長至90%左右時用0.25%胰酶消化離心后傳代。

1.2.2 乳腺腫瘤細胞條件培養基的獲取乳腺癌MCF-7與MDA-MB-468細胞生長于10% FBS的高糖DMEM培養基，待細胞密度生長至約70%～80%，將培養液更換為1% FBS的培養基繼續培養30 h后，將培養基收集后離心，其上清液即為腫瘤細胞條件培養基（conditioned medium，CM）[13]。

1.2.3 CAFs與乳腺癌細胞共培養模型根據實驗需求選取以下方式：⑴收集腫瘤細胞CM處理CAFs細胞 36 h；⑵Transwell小室法共培養 24 h，CAFs細胞種于上室，腫瘤細胞種于下室，細胞比例為3:1。分別得到CAFs+MCF-7與CAFs+MDAMB-468共培養細胞模型[13]。

1.2.4 GPER核輸出信號（NES）序列突變依托上海吉碼制藥技術有限公司對GPER NES序列：YFINLAVADLILV的核心區域LIL進行突變，得到突變型YFINLAVADAAAV的質粒，課題組已在前期研究中用脂質體2000轉染等方法獲得穩定篩選的GPER NES序列突變型細胞株CAFs（M）[13]。

1.2.5 細胞免疫熒光檢測CAFs細胞中GPER表達定位取單獨培養及共培養條件下對數期生長的野生型CAFs與突變型CAFs（M）細胞胰酶消化離心重懸后以2×105/mL接種于底部放有小玻片的24孔板中，置于細胞孵箱中培養，待細胞生長狀態及密度合適后，取出24孔板用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛200 μL固定20min，PBS洗3次，10%山羊血清37℃封閉30 min，加入GPER抗體（1:100稀釋）30～40 μL，4℃孵育過夜，PBS洗3次，暗室中加入FITC熒光二抗（1:200），37℃60min，PBS洗3次，加入DAPI（1:10）染核5min，PBS洗3次，每次 5 min，封片后，倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 熒光定量PCR檢測CAFs細胞中FGF2 mRNA表達量CAFs細胞單獨培養或取不同的共培養細胞模型，待CAFs細胞生長至70%～80%后，更換無血清培養基饑餓24 h。分別加入100 nmol/L E2與100 nmol/L G1 處理 CAFs細胞12 h（藥物處理濃度參考研究團隊前期研究[13]），各組調整DMSO至一致，最后分別得到對照組、E2處理組、G1處理組，處理相應時間后立即終止藥物處理，用TRIzol試劑提取各組CAFs細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA。逆轉錄及PCR反應均按照TaKaRa試劑盒及熒光定量PCR試劑盒說明進行操作。FGF2上游引物序列為5'-AGC CAG GTA ACG GTT AGC AC-3'，下游引物序列為5'-GGA GAA GAG CGA CCC TCA C-3'；以 β-actin為內參對照，上游引物序列為5'-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3'，下游引物序列為5'-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3'。實驗重復 3 次。

1.2.7 ELISA 法檢測 CAFs細胞上清中 FGF2的分泌量實驗分組同1.2.6，待CAFs細胞生長至80%～90%后，更換無血清培養基饑餓24 h。分別加入100nmol/LE2與100nmol/LG1處理CAFs細胞24 h，各組調整DMSO至一致，最后分別得到對照組、E2處理組、G1處理組，處理相應時間后立即終止藥物處理，收集細胞上清液，保存于-80℃冰箱，按ELISA試劑盒操作說明書檢測各組樣本中FGF2的含量。實驗重復3次。

1.2.8 流式細胞術檢測乳腺癌細胞周期取對數生長期MCF-7、MDA-MB-468與CAFs細胞胰酶消化離心重懸后，接種于6孔板及Transwell小室中，用10%胎牛血清的無酚紅高糖DMEM培養基培養至腫瘤細胞密度達到約50%，移去培養基，PBS洗2次，加入無血清無酚紅DMEM培養基饑餓24 h，使各組細胞周期同步于G0/G1期。分別加入100 nmol/L E2、100 nmol/L G1與2 μg/mL FGF2中和抗體處理上室中CAFs細胞24 h，各組調整DMSO至一致，24 h后收獲下室中乳腺癌細胞，70%乙醇固定，置于4℃冰箱過夜，PI染色避光室溫孵育30 min，流式細胞儀檢測腫瘤細胞中各細胞周期中DNA的含量。實驗重復3次。

1.2.9 CCK8法檢測乳腺癌細胞增殖實驗分組及方法同1.2.8，乳腺癌細胞與CAFs分別接種于96孔板及Transwell小室中，加入100 nmol/L E2、100nmol/LG1與2μg/mL FGF2中和抗體處理上室中CAFs細胞24 h，各組調整DMSO至一致，24 h后取出 Transwell小室，每孔加入10 μL CCK-8試劑，細胞孵箱中孵育2 h，酶標儀測定各孔的吸光度（OD值），波長選擇450 nm，獲得各組相對細胞數。實驗重復3次。

1.3 統計學處理

數據用均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 17.0統計軟件，多組間比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同類型乳腺癌細胞均可誘導CAFs中GPER發生細胞漿轉位

細胞免疫熒光實驗表明：CAFs細胞單獨培養條件下，GPER主要表達于細胞核，而與ER+乳腺癌MCF-7及ER-乳腺癌MDA-MB-468細胞共培養后，CAFs中GPER的表達定位由細胞核轉位入細胞漿中；GPER NES序列突變后，上述兩種類型的乳腺癌細胞均不能使CAFs（M）中GPER發生核漿轉位，與前期結果一致[13]（圖1）。

圖1 免疫熒光法檢CAFs細胞中GPER的表達定位（綠色熒光代表目的蛋白GPER，藍色熒光代表細胞核；×400）Figure 1 Determination of GPER expression localization in CAFs by immuno fl uorescence(green fl uorescence showing GPER,and blue fl uorescence showing the cell nucleus;×400)

2.2 共培養條件下，E2與G1上調CAFs細胞中FGF2的表達及分泌

實時熒光定量PCR結果顯示，共培養條件下，分別用E2和G1處理CAFs細胞12 h后，均可上調細胞內FGF2 mRNA表達水平，明顯高于對照組（均P＜0.05）。ELISA結果進一步顯示，藥物處理24 h后，E2及G1明顯促進共培養模型CAFs細胞上清液中FGF2的分泌量（均P＜0.05）。而單獨培養條件下，則無上述現象（圖2）。

突變共培養模型CAFs中GPER NES序列后，E2與G1的上述作用被取消，與對照組比較無統計學差異（均P＞0.05）（圖3）。

圖2 熒光定量PCR及ELISA檢測CAFs中FGF2 mRNA表達及上清液中FGF2含量 1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與CAFs+E2組比較，P＜0.05；3）與CAFs+G1組比較，P＜0.05Figure 2 Detection of FGF2 mRNA expression in CAFs and FGF2 level in culture supernatant by real-time qPCR and ELISA 1)P＜0.05vs.blank control;2)P＜0.05vs.CAFs alone+E2;3)P＜0.05vs.CAFs alone+G1

圖3 突變GPER NES序列對CAFs中FGF2 mRNA表達及上清液中FGF2含量的影響 1）與對照組比較，P＜0.05；2）與CAFs（M）+E2 組比較，P＜0.05；3）與CAFs（M）+G1 組比較，P＜0.05Figure 3 In fl uences of GPER NES sequence mutation on FGF2 mRNA expression in CAFs and FGF2 level in culture supernatant 1)P＜0.05vs.blank control;2)P＜0.05vs.CAFs(M)+E2;3)P＜0.05vs.CAFs(M)+G1

2.3 CAFs中細胞漿GPER介導的FGF2旁分泌促進乳腺癌細胞周期進展

細胞周期結果顯示，分別用E2和G1處理共培養模型中CAFs細胞24 h后，兩種藥物均可降低乳腺癌MCF-7與MDA-MB-468細胞周期中靜止期（G0/G1期）細胞的比例，促進細胞周期向增殖期（S期與G2/M期）進展。其中E2及G1處理后腫瘤細胞處于S期的DNA改變量最為明顯（P＜0.05），其促細胞周期進展的效應被FGF2的特異性中和抗體所阻斷（圖4）。

2.4 CAFs中細胞漿GPER介導的FGF2旁分泌增強乳腺癌細胞增殖能力

CCK-8法檢測結果進一步顯示，E2及G1處理CAFs細胞24 h后，可明顯促進共培養模型中乳腺癌細胞增殖，且其促增殖效應被FGF2中和抗體所拮抗（圖5）。

圖4 流式細胞術檢測共培養條件下乳腺癌細胞的細胞周期 1）與對照組比較，P＜0.05；2）與E2+FGF2中和抗體組比較，P＜0.05；3）與G1+FGF2中和抗體組比較，P＜0.05Figure 4 Detection of cell cycle of the breast cancer cells under co-culture condition by flow cytometry 1)P＜0.05vs.control;2)P＜0.05vs.E2+FGF2 neutralizing antibody;3)P＜0.05vs.G1+FGF2 neutralizing antibody

圖5 CCK-8法檢測共培養條件下乳腺癌細胞增殖情況1）與對照組比較，P＜0.05；2）與E2+FGF2中和抗體組比較，P＜0.05；3）與G1+FGF2中和抗體組比較，P＜0.05Figure 5 Determination of breast cancer cells proliferation under co-culture condition by CCK-81)P＜0.05 vs.control;2)P＜0.05vs.E2+FGF2 neutralizing antibody;3)P＜0.05vs.G1+FGF2 neutralizing antibody

3 討 論

腫瘤的發生發展不僅僅被認為是腫瘤實質細胞本身的單獨作用，其微環境成分也同時作為腫瘤的核心特征被廣泛接受[18-19]。研究團隊前期體外實驗數據顯示CAFs單獨培養條件下GPER主要表達于細胞核中，而這與免疫組化實驗所觀察到GPER主要表達于腫瘤間質成纖維細胞（tumor stromal fibroblasts，TSFs）中細胞漿的結果不相符合[13]。事實上，生理條件下CAFs可能受到腫瘤組織中多種成分的影響，而腫瘤實質細胞與CAFs是乳腺腫瘤中最主要的兩大成分，因此提示在體內環境乳腺癌細胞可能影響CAFs中GPER的細胞內定位。僅僅單獨研究CAFs中GPER的生物學功能可能是不妥的，乳腺癌細胞與CAFs之間的“交叉對話”須考慮在內，這更加符合實體腫瘤真實的“內部環境”。本研究在不同類型的乳腺癌（ER+型MCF-7與ER-型MDA-MB-468）細胞中均證實了GPER的核漿轉位現象，提示CAFs中GPER的核漿轉位可能是乳腺腫瘤的普遍特點之一，其在腫瘤進展及藥物耐受中或發揮關鍵性作用，可能是潛在的治療靶點。

近年來，GPER所介導的腫瘤旁分泌效應越來越被諸多研究者所關注。郭林英等[20]報道CAFs中GPER可介導細胞因子HMGB1外分泌促進ER+乳腺癌細胞自噬。此外，在ER-乳腺癌細胞中，雌激素還可通過活化GPER自分泌炎癥因子IL-6進而促進腫瘤細胞快速生長[21]。同樣，筆者在前期研究中也證實GPER創造乳酸微環境引起乳腺癌細胞能量代謝重塑從而導致腫瘤細胞的臨床多藥耐受[13]。本研究進一步明確了乳腺癌微環境GPER與成纖維細胞因子家族成員FGF2的潛在調控關系：共培養條件下雌激素活化CAFs中細胞漿GPER促進FGF2的表達及旁分泌，突變GPER的NES序列（GPER位于CAFs細胞核）后可阻斷上述效應。同時，CAFs單獨培養條件下則未觀察到上述現象，更進一步提示共培養下微環境GPER細胞漿定位的獨特生物學作用。然而，CAFs中雌激素/GPER/FGF2信號軸活化的具體機制尚不明確，有待后續實驗的進一步研究。

現有研究表明，FGF2的過量表達及下游信號的過度活化參與腫瘤惡性臨床進展[22-23]。在慢性髓系白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）中，FGF2表達異常升高將導致CML細胞對靶向藥物伊馬替尼治療不敏感[24]。Terai等[25]則證實非小細胞肺癌中FGF2及其受體FGFR1活性增強將引起腫瘤細胞快速增殖及轉移，且對靶向藥物吉非替尼出現耐藥。同樣，本研究也得到類似結果：微環境GPER所介導的FGF2旁分泌可顯著促進乳腺癌細胞周期進展及腫瘤快速生長，應用FGF2的特異性中和抗體可明顯逆轉以上效應，提示靶向阻斷CAFs中雌激素/GPER/FGF2信號通路可能是對抗腫瘤臨床進展的新型治療模式，但這還需要更多的體外及體內實驗來進一步驗證與支持。