微管相關蛋白tau在乳腺癌中表達及臨床意義的生物信息學分析

趙東怡，周恩相，李倫，楊永萍，謝萍芳

（1.中南大學湘雅二醫院 乳甲外科，湖南 長沙 410011；2.復旦大學腫瘤研究所，上海 200433；3.遼寧省丹東市婦幼保健醫院 婦科，遼寧 丹東 118000）

近年來，乳腺癌的發病率迅速增長，無論是發達國家還是發展中國家，乳腺癌都是女性目前最為常見的癌癥。根據全球腫瘤流行病統計數據，2018年全球乳腺癌新發病例數為2088849例，乳腺癌的發病率和病死率都躍居女性惡性腫瘤中的首位[1]。在我國，乳腺癌也是女性發病率最高的惡性腫瘤，據我國癌癥中心公布的最新數據表明，我國女性乳腺癌年發病例數可達30.4萬例，死亡例數約3.1萬例，嚴重威脅著女性的健康[2-4]。目前乳腺癌的主要治療方法是以手術為主的綜合治療[5-6]，雖然乳腺癌的診療水平不斷提高，但乳腺癌的復發、放化療等治療對機體的毒副作用和綜合治療的高額費用仍給患者帶來了軀體和心理的雙重影響，同時也給家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔。

微管相關蛋白tau（microtubule-associated protein tau，MAPT）是細胞內紡錘體的主要構成部分，是一種微管相關蛋白，其編碼基因位于17q21.3，包括15個外顯子，可促進細胞骨架微管的聚合、穩定，調節微管蛋白動力學變化，首次被報道是在關于阿爾茲海默病的研究中，與神經系統退行性疾病有關[7]。有研究[8]表明，MAPT表達在乳腺癌中有一定意義。目前乳腺癌中MAPT表達的臨床意義的研究尚不全面，本研究使用生物信息學的方法，分析乳腺癌中MAPT的表達情況，對MAPT預測乳腺癌耐藥、預后進行探究，為乳腺癌的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數據來源及研究內容

基于TCGA數據庫（https://cancergenome.nih.gov）和bc-GenExMiner數據庫（http://bcgenex.centregauducheau.fr）中乳腺癌組織及正常乳腺組織的測序結果，分析MAPT在正常乳腺組織與乳腺癌組織中的表達情況，分析不同臨床分期、月經狀態、分子分型的乳腺癌組織中MAPT的表達差異?；贕EO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles），以“MAPT+BREAST+RESISTANCE”為關鍵詞進行檢索，收集關于MAPT與化療耐藥、內分泌耐藥及靶向治療耐藥的數據集，分析MAPT與乳腺癌化療、內分泌和靶向治療耐藥之間的關系。從Kaplan Meier Plotter數據庫（http://kmplot.com/analysis）中獲取有關乳腺癌預后的相關數據，分析MAPT在不同分子分型乳腺癌中與總生存期（overall survival，OS）和無復發生存期（recurrence-free survival，RFS）之間的關系，繪制Kaplan-Meier曲線。

1.2 統計學處理

使用SPSS Statistics 21軟件對數據進行t檢驗或t'檢驗，統計檢驗均采用雙側檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。數據以均數±標準差（±s）或中位數（四分位數間距）[M（IQR）]來表示。

2 結 果

2.1 MAPT在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達情況

對TCGA中1097例乳腺癌和114例正常乳腺組織的數據進行分析，發現MAPT在正常乳腺組織中表達水平為17.964（13.532～25.455），在乳腺癌組織中表達水平為25.768（4.77～58.728），其在乳腺癌組織中表達高于正常乳腺組織（P＜0.01）。分析不同的分子分型乳腺癌中MAPT表達水平，566例Luminal型乳腺癌中MAPT表達水平為34.612（13.720～66.167），高于正常乳腺癌組織（P＜0.01），37例HER-2型乳腺癌組織中表達水平為1.882（0.909～6.136），116例三陰型乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）組織中表達水平為1.013（0.496～2.623），均低于正常乳腺癌組織（均P＜0.01）。分析其在不同臨床分期乳腺癌中表達水平，183例I期乳腺癌組織中MAPT表達水平為41.311（11.196～69.101），在615例II期乳腺癌中表達水平為23.152（3.507，59.974），在247例III期乳腺癌中表達水平為21.817（6.445～46.555），20例IV期乳腺癌組織中表達水平為13.861（5.877～22.036），I、II、III期乳腺癌中MAPT的表達均高于正常乳腺癌組織（均P＜0.01），II、III、IV期乳腺癌組織中MAPT表達均高于I期乳腺癌（均P＜0.05）。IV期乳腺癌和正常乳腺癌組織中表達無統計學差異（P＞0.05）。230例絕經前乳腺癌中表達水平為29.106（4.934～58.015）、700例絕經后乳腺癌中表達水平為23.837（5.014～59.210），絕經前患者和絕經后患者癌組織中MAPT的表達均高于正常乳腺組織（P＜0.05）（圖1）。

圖1 MAPT在乳腺癌中表達情況Figure1 Expressions of MAPT in breast cancer

分析bc-GenExMiner數據庫中1525例ER陰性乳腺癌、3923例ER陽性乳腺癌、946例PR陰性乳腺癌和1439例PR陽性乳腺癌發現，MAPT在ER、PR陽性乳腺癌中表達量明顯高于ER、PR陰性乳腺癌，兩者差異具有統計學意義（均P＜0.0001）。分析Ki-67高表達的2672例乳腺癌和Ki-67低表達的2673例乳腺癌中MAPT轉錄表達量，發現Ki-67低表達乳腺的MAPT表達水平較Ki-67高表達的乳腺癌高，兩者差異具有統計學意義（P＜0.0001）。對201例HER-2陽性乳腺癌和1409例HER-2陰性乳腺癌進行分析，發現HER-2陽性乳腺癌的MAPT表達量明顯低于HER-2陰性乳腺癌，兩者差異也具有統計學意義（P＜0.0001）（圖2）。

圖2 MAPT表達與ER、PR、HER-2、Ki-67的關系Figure 2 Relations of MAPT expression with ER,PR,HER-2 and Ki-67

2.2 MAPT與乳腺癌內分泌耐藥、化療耐藥以及靶向治療耐藥的關系

分析GEO數據庫中與的數據發現，數據集GDS360中331_at這一基因片段表達量在多西他賽耐藥組與敏感組中分別為116.83±35.28（n=14）和81.89±14.02（n=10），114_r_at表達量在多西他賽耐藥組及敏感組分別為48.05±37.58（n=14）和20.03±16.19（n=10），MAPT在多西他賽耐藥乳腺癌中表達水平較高（P＜0.01）。對數據集GDS4083進行分析，發現拉帕替尼耐藥組206401_s_at片段表達量為284.74±69.29（n=12），敏感組中為184.31±35.84（n=6），206401_s_at片段在耐藥組和敏感組的表達量分別為187.38±34.59（n=12）和139.94±12.21（n=6），MAPT在拉帕替尼耐藥組中的表達量明顯高于敏感組（P＜0.01）。對數據集GDS4051進行統計分析，發現203929_s_at、225379_at、203928_x_at、206401_s_at 4個片段在他莫昔芬耐藥組中表達量均低于敏感組（均P＜0.01）（表1）。

2.3 MAPT與乳腺癌預后的關系

分析Kaplan Meier Plotter數據庫中3955例乳腺癌患者的總生存期數據并繪制生存曲線，發現MAPT高表達乳腺癌患者OS高于低表達患者（HR=0.65，95%CI=0.48～0.89，P＜0.01）。分別分析各個分子分型，在Luminal A型乳腺癌中，MAPT高表達乳腺癌的OS高于低表達患者（HR=0.38，95%CI=0.23～0.63，P＜0.05），MAPT與Luminal B型、HER-2型乳腺癌OS無明顯關系（均P＞0.05）。對于TNBC，MAPT表達量低的乳腺癌患者OS更高（HR=2.91，95%CI=1.54～5.5）。

對Kaplan Meier Plotter數據庫中1402例乳腺癌患者的RFS進行統計分析，結果顯示MAPT高表達的乳腺癌患者R F S高于其低表達患者（HR=0.59，95%CI=0.51～0.69，P＜0.05）。在Luminal A型的乳腺癌患者中，MAPT高表達患者R F S高于其低表達患者（H R=0.64，95%CI=0.49～0.82，P＜0.01）。TNBC中，MAPT高表達患者的RFS低于其低表達患者（HR=1.45，95%CI=1.04～2.04，P＜0.05）。而Luminal B型和HER-2型乳腺癌患者中，MAPT表達量與RFS無明顯關系（均P＞0.05）（圖3）。

表1 MAPT與乳腺癌化療、內分泌治療、靶向治療耐藥的關系Table 1 Relations of MAPT expression with the resistance to chemotherapy,endocrine therapy and targeted therapy of breast cancer

圖3 MAPT與乳腺癌預后的關系Figure 3 Relationship between MAPT and prognosis of breast cancer

3 討 論

目前，在乳腺癌治療方面，大多為手術為主輔以術后放化療、內分泌治療及靶向藥物治療，紫杉類藥物和雌激素受體抑制劑是臨床上最常使用的乳腺癌化療及內分泌治療藥物[9-10]。臨床上對于乳腺癌預測及預后有許多不同的分子標志物。除了患者年齡、腫瘤大小、淋巴結狀態、組織學分級、遠處轉移狀態等影響預后的因素，傳統的乳腺癌預后因子包括ER、PR、HER-2、Ki-67、血管生成因子、凋亡相關因子等等，但是這些指標已經不能滿足臨床上個體化治療乳腺癌的需求，需要更多、更精確的預測因子對乳腺癌的預后及耐藥性進行預判[11]。

通過對乳腺癌組織與正常乳腺組織中MAPT表達量、耐藥及敏感細胞株中MAPT表達量數據的生物信息學分析發現，MAPT在正常乳腺組織及乳腺癌組織中均有表達，且在乳腺癌組織中高表達。I、II、III期乳腺癌中MAPT表達量均高于正常乳腺組織，在IV期乳腺癌和正常乳腺癌之間沒有發現這種差異，猜測MAPT在IV期乳腺與正常組織無表達差異是由于晚期癌癥已經發生遠處轉移，有相當一部分患者的一般情況較差，甚至發生惡病質，機體代謝失調導致供能不足，而腫瘤細胞異常增生需要大量的原料和能量，缺乏營養支持的腫瘤細胞代謝活躍性減低，故與細胞有絲分裂相關的MAPT表達水平降低。也有可能是因為IV期乳腺癌大多局部已經有了變性、壞死，對MAPT的表達結果存在一定的影響。本研究顯示，MAPT的表達也與乳腺癌的分子分型相關，Luminal型乳腺癌具有較高的MAPT表達，而HER-2型及TNBC組織中MAPT低表達。MAPT表達與雌、孕激素受體、HER-2及Ki-67表達均相關。有研究發現ER陽性乳腺癌中MAPT表達顯著低于ER陰性乳腺癌，Andre等[12]認為這提示著ER參與MAPT調控。Pentheroudakis等[13]對200多例乳腺癌組織進行實時定量PCR實驗，也發現MAPT與ER、PR密切相關。Pusztai等[8]發現ER陽性乳腺癌中MAPT陽性結果更多，而HER-2陽性的乳腺癌中MAPT陽性結果較少，這與本研究結果一致。本研究表明MAPT表達與臨床分期以及ER、PR、HER-2、Ki-67這幾個常見的乳腺癌分子標志物均有相關性，而已經有大量研究實驗表明，這些因素與乳腺癌的預后、耐藥、分化程度緊密相關[14-16]，這提示MAPT也有成為預測乳腺癌耐藥及預后的新的分子標志物的潛力。

本研究表明，MAPT高表達乳腺癌對紫杉類化療藥有耐藥性。Rouzier等[15]使用siRNA（小干擾RNA）下調紫杉醇敏感細胞株ZR75.1和MCF-7中MAPT的表達，結果表明，下調MAPT表達后乳腺癌對紫杉醇的敏感性明顯升高。紫杉類藥物的作用靶點在微管，它可以通過與微管的結合阻止其解聚，從而影響乳腺癌細胞的有絲分裂，MAPT影響乳腺癌對紫杉類藥物敏感性的機制可能是由于MAPT蛋白與紫杉醇和微管結合的位點是相同的，但不具備阻止微管解聚的功能，故MAPT高表達導致乳腺癌細胞對紫杉醇耐藥[17]。有研究表明，MAPT基因啟動子上游存在雌激素應答元件，雌激素與雌激素受體結合后可通過與雌激素應答元件結合啟動轉錄和翻譯。MAPT水平可一定程度反應乳腺癌細胞中雌激素活性，因此MAPT有可能預測內分泌治療效果[13,18]。此外，有研究[19]表明ER可影響MAPT表達，選擇性雌激素受體抑制劑氟維司群可下調MAPT表達，增加MAPT陽性、ER陽性乳腺癌細胞對紫杉類化療藥的敏感性。長期以來，同時使用內分泌藥物和化學藥物聯合治療乳腺癌一直飽受爭議，臨床上大多使用化療序貫內分泌治療，已經有一些學者提出患者可以從化療聯合內分泌治療得到更多獲益[20-21]，而選擇性雌激素受體對MAPT的調節作用更是為我們提供了一種聯合使用內分泌治療和化療的可能性。拉帕替尼是一種小分子氨基酸激酶抑制劑，它通過與APT結合位點結合抑制其磷酸化從而抑制腫瘤生長，其耐藥成因較復雜，包括PIK3CA的激活性突變[22]、HER-2基因的K753E突變等[23]，本研究觀察到MAPT與乳腺癌拉帕替尼耐藥有相關性。MAPT蛋白在微管形成、解聚中發揮的作用可以影響乳腺癌細胞的增殖，這可能會成為新的乳腺癌防治策略。在乳腺癌術后化療的方案選擇上，可以對乳腺癌組織進行MAPT基因檢測以制定精準的個體化治療方案，MAPT高表達乳腺癌患者應避免使用紫杉類藥物作為主要化療方案，而低表達乳腺癌患者可積極使用紫杉類化療藥，以此取得更好療效，預防乳腺癌的術后復發。

研究[24]發現MAPT高表達而微管解聚蛋白低表達乳腺癌具有更高的DFS，且MAPT與微管解聚蛋白表達量比值與DFS呈正相關關系，兩者比值可以作為OS的獨立預測因子，還有體外試驗表明MAPT在乳腺癌中高表達與較好的預后相關[25]。本研究發現乳腺癌中MAPT表達量顯著高于正常乳腺組織，而MAPT高表達乳腺癌有較好的OS與RFS，這提示MAPT可能不僅僅有單一的抑癌作用或者促癌作用，有的腫瘤相關因子已經被發現既有抑癌作用也有促癌作用，比如轉化生長因子β（TGF-β），目前有研究表明，在腫瘤發育的不同時期，TGF-β可以發揮不同的作用，在腫瘤發生早期，抑制細胞增殖[26]；而在腫瘤發展到晚期時，TGF-β可促使上皮細胞向間充質細胞轉化，使得腫瘤細胞具有轉移、浸潤的傾向，此外在腫瘤晚期它還可刺激腫瘤血管生成并使機體對腫瘤細胞產生免疫抑制[27]。由此可見，某個分子在癌癥發生、發展這一序貫過程中，起到的作用可能是不同的。所以MAPT也可能在腫瘤早期起到促進腫瘤生長的作用，然而在腫瘤晚期這種促癌的作用逐漸被抑癌的作用取代，故MAPT高表達的反而表現出更好的預后。最近也有研究[28]表明，PLK1基因在多種腫瘤細胞中過表達，但實際有抑癌作用。此外，在有些研究[29]中，抑癌基因P27也被發現具有促癌的特性。在個別的研究中，有學者[12]發現MAPT的表達水平與沒有接受過輔助治療的乳腺癌患者的“自然預后”沒有相關性，這提示著MAPT可能是通過影響乳腺癌的內分泌、化療、靶向治療的效果改變預后，也就是說MAPT對乳腺癌的預后影響也取決于患者接受輔助治療情況。本研究還發現，總體來說，MAPT高表達的乳腺癌預后較好，單獨統計Luminal A型的數據也是如此，但TNBC除外，MAPT對乳腺癌的預后與乳腺癌分子分型相關。這與PLK1很相似，研究人員發現在HER-2陽性的腫瘤中，PLK1過表達的患者預后較好，而在ER受體陽性乳腺癌中，PLK1過表達的患者預后差，PLK1對腫瘤預后的作用也取決于腫瘤的亞型[28]。當然，上述僅提出了一些可能性，未來仍需要更多的細胞生物學實驗來驗證MAPT的抑癌機制及進一步探求其與乳腺癌預后的關系。

本研究結果顯示MAPT高表達乳腺癌對紫杉類藥物耐藥，但預后更好，筆者分析，這可能有兩點原因，第一，MAPT高表達乳腺癌雖然對紫杉類藥物耐藥，但對雌激素受體抑制劑敏感，可以取得更好的內分泌治療效果，從而表現出更好的預后，有研究[30]表明，在特定的乳腺癌患者中，內分泌治療的獲益更多，St Gallen專家共識[31]也認為對于某些患者來說內分泌治療更加重要，所以推測某些情況下雌激素受體抑制劑敏感比紫杉類藥物耐藥對預后的影響可能更大。第二，本研究選擇了紫杉類藥物作為研究的主要對象，但臨床上在制定乳腺癌化療方案時通常使用2～3種藥物聯合方案，如環磷酰胺、多柔比星等藥物，MAPT的表達與其他類型化療藥物的關系尚不明確，因此不能排除MAPT高表達乳腺癌對紫杉類藥物耐藥而對其他化療藥物敏感性高的可能性。

本研究使用生物信息學方法和各種生物信息工具對MAPT在乳腺癌中表達意義做了較為全面的分析，但是本研究也存在一定的局限性，本研究所采用的數據來源于公共數據庫，在數據處理和上傳過程中遵循一定的格式，可能會丟失一部分原始數據，公共數據庫中納入的乳腺癌病例來自不同地區種族的人群，可能存在一定種族差異，且生物信息工具有各自的適用范圍，為了更好的了解MAPT與乳腺癌耐藥、預后的關系，仍有必要在進一步研究中設計合理的細胞生物學實驗加以驗證。

綜上，MAPT在乳腺癌中高表達，且不同分型乳腺癌中的表達具有一定差異。MAPT與乳腺癌的耐藥和預后密切相關，高表達的乳腺癌患者可能對紫杉類藥物耐藥而對他莫昔芬敏感，且可能具有更好的預后。因此，MAPT是一個非常有潛力的乳腺癌預后因子，也是他莫昔芬敏感性和紫杉醇耐藥性的雙功能預測因子，有可能為防治乳腺癌及預防其術后復發提供新的思路，值得更進一步的研究。