白酒大曲風味物質研究進展

周晨曦，鄭福平*，李賀賀，吳繼紅，黃明泉，孫寶國

（1.北京工商大學 食品學院 北京市食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048；2.北京工商大學 食品學院 食品質量與安全北京實驗室，北京 100048）

白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一。2017年，國內白酒累計完成銷售收入5 654.42億元，與上年同期相比增長了14.42%，釀酒總產量達到1 198.06萬kL，可謂是中國的國民酒。俗話說“水是酒的血，曲是酒的骨，糧是酒的肉”、“有美酒必備佳曲”。曲是釀酒所用的糖化發酵劑，其質量決定了白酒的產量和質量[1]。按照制曲工藝，白酒酒曲可分為三類：大曲、小曲和麩曲[2]。大曲是以小麥為主要原料、經粉碎后加水壓制、在人工控溫條件下培育而成的曲塊，含有多種菌類及酶類物質，因其相對于小曲形狀較大，又稱為塊曲[2-3]。由于富含各類微生物，在制曲和釀造過程中，這些微生物的生長和繁殖產生了大量的代謝物，進一步賦予各種大曲酒獨特的風格與特色，這是其他酒曲所不能比擬的[4]，因此，我國的名優酒大都采用大曲釀造。茅臺酒、瀘州老窖和汾酒作為3種最著名的典型白酒風味代表（醬香型、濃香型和清香型），均使用大曲作為糖化發酵劑。

本文簡介了白酒大曲的制作工藝及分類，總結了大曲風味物質研究現狀，包括前處理方法、定性定量方法和已檢出風味物質的研究進展，為研究大曲風味物質提供參考。

1 大曲的制作工藝與分類

大曲的培養具有生料制曲、自然網羅微生物、季節性強、堆積培養和培養周期長的特點[4]。因其香型、曲塊不同，制作工藝也有區別，但一般分為五步：選配原料、粉碎拌料、壓制成型、入室培養和貯曲保存[4-7]。

按照制曲過程中的最高品溫，大曲一般分為三類：高溫曲、中溫曲和低溫曲。高溫曲制曲時最高品溫高于60℃，一般用于生產醬香型白酒，以茅臺酒為代表，也有部分芝麻香型和兼香型白酒使用高溫曲；中溫曲制曲時最高品溫控制在50～60℃，一般用于釀造濃香型白酒，部分鳳香型、老白干香型和特香型白酒也采用中溫曲，但原料配比、制作工藝各有差異；低溫曲制曲時最高品溫低于50℃，一般用于釀制清香型白酒，以汾酒為典型。也有將不同大曲混合使用的，如景芝白干酒大曲以純小麥為原料，或小麥、大麥和豌豆混合制曲，將中溫曲（最高品溫50～55℃）與高溫曲（最高品溫高于65℃）混合使用；扳倒井酒大曲以小麥為原料，將高溫曲（最高品溫高于65℃）與多種微生物培養麩曲聯合使用[8]；馥郁香型酒鬼酒則將大曲與小曲結合使用，使用的大曲以純小麥為原料，制曲最高品溫達57～62℃。各名優酒廠傳統制曲原料配比和最高品溫總結見表1。

表1 各名優酒廠傳統制曲原料配比及最高品溫總結Table 1 Summary of the ratio of traditional Daqu-making materials and the maximum incubation temperatures of various famous Baijiu

2 大曲研究現狀

大曲中含有多種微生物菌系和各種釀酒酶系。從Web of Science數據庫中檢索有關“大曲”和“白酒”的研究論文，截止2018年11月總共發文量為246篇，出現頻率較高的詞如微生物和菌株均為微生物研究方面，即目前關于大曲的大部分研究主要集中在微生物群落結構研究[10]和功能微生物研究上[11-12]。LIU J J等[13]研究發現，同種的水解酶與不同大曲中的代謝產物相關性不一致，如淀粉酶在清、濃香型大曲中與糖代謝物呈正相關，而在醬香型大曲中與糖代謝和蛋白質代謝相關。

大曲除了是大曲酒釀造中的糖化發酵劑以外，也是生香劑。在制曲過程中，原料的分解產物和微生物的代謝產物，直接或間接地構成了白酒的風味物質。WANG W Y等[14]從茅臺大曲中分離出了一株枯草芽孢桿菌，并認為在經過多輪微生物發酵后，通過美拉德反應將孢子的重要組分2,6-吡啶二羧酸（或其衍生物）轉化為各吡啶類化合物——茅臺酒的特征香物質?？肺妒前拙浦械碾s味之一，尤其是清香型白酒中的主要雜味，而這一雜味的源頭為呈土味、霉味的土味素。DU H等[11，15]對不同成熟階段的大曲（老白干、汾酒）進行了研究，結果表明，土味素的主要來源可能是大曲中鏈霉菌代謝產生。

同時，大曲的質量直接決定了基酒的質量，對于大曲質量的判斷、鑒別除了理化檢測外，感官鑒評也尤其重要。感官鑒評主要通過外觀和聞香判定，聞香即對大曲中的揮發性香氣成分所表現的綜合香氣進行感官評價[16]。因此，研究大曲中豐富的香氣成分不僅有助于研究白酒的香氣成分，還有助于對大曲質量的判別。

有關大曲風味物質的研究最早可追溯到2006年，趙東等[17]首次利用頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析了五糧液釀造用的一級、二級和三級大曲的揮發性成分，共對68種揮發性和半揮發性成分進行了定性，發現大曲中的許多微量香氣成分如己酸、己酸乙酯和乙酸乙酯等與基礎酒中的香氣成分相似。范文來等[18]利用HS-SPME和GC-MS分析了某醬香型大曲中的揮發性成分，共檢測到112種揮發性成分，包括酸類、硫化物、呋喃類化合物、醛類、酯類、酮類、醇類、芳香族和吡嗪類等多種化合物，其中，含量最高的是酸類和吡嗪類化合物，單個化合物含量最高的是異戊酸。張春林等[19]利用HS-SPME和GC-MS分析檢測了瀘州老窖大曲中的揮發性成分，主要為醇類、吡嗪類、酯類、酮類和醛類，其中單個化合物的含量最高的化合物是2-戊醇。LE V D等[20]利用HS-SPME與GC-MS研究了汾酒大曲七個溫曲過程（臥曲、上霉、晾霉、潮火、大火、后火和養曲）中揮發性化合物的變化，共鑒定出83種主要揮發性化合物，并結合主成分分析（principal component analysis，PCA），發現造成溫曲不同階段風味差異的化合物主要是己醛和（E）-2-辛烯醛等。胡沂淮等[21]利用索氏提取法結合GC-MS對洋河大曲進行了分析檢測，共檢測出39種揮發性成分，以有機酸類最多，其次是含氮化合物。發現大曲中所含有的揮發性成分主要是白酒中香氣成分的前體物質。如異戊醇、1,2-丙二醇、正戊酸、正丁酸等既是風味前體物質又是成品酒的風味物質，四甲基吡嗪、乙醛縮二乙醇和丁內酯等是成品酒的風味物質，N,N-二甲基乙酰胺和1H-吡咯-2-甲醛等是風味前體物質，這些物質經發酵、蒸餾等工藝后消失。邢鋼等[22]應用HS-SPME結合GC-MS對瀘州老窖大曲制曲過程中揮發性成分進行了動態分析。共檢測到54種揮發性成分，其中醇類最多。動態分析結果表明，大部分揮發性成分（醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、酚類和芳香族化合物）含量呈現先增后減的趨勢，在8 d時達到最大值，隨后下降，到貯存后期含量趨于穩定；大部分含氮化合物在發酵前期均沒有檢測到，發酵后期含量逐漸增加，隨著貯存時間增長含量又逐漸減少。陳美竹[16]利用HS-SPME和GC-MS分析檢測了3種醬香型高溫大曲（生產用曲、出倉黃曲和出倉白曲）的揮發性成分，共定性了40種化合物，包括12種雜環類化合物，其中以吡嗪類最多。孟維一等[23]利用HS-SPME和氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）研究了兩個芝麻香型酒廠生產的高、中、低溫大曲，共檢出69種揮發性化合物，棕櫚酸甲酯在所有大曲樣品中都有檢出，且含量都相對較高。嗅聞結果顯示，共有17種香氣活性化合物可被至少兩個嗅聞人員聞到，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪的香氣活性（odor activity value，OAV）值最高。李登勇等[24]以來源于不同生產地、企業和陳曲時間的醬香型大曲為研究對象，利用HS-SPME和GC-MS研究了其揮發性組分特征。共檢出113種揮發性化合物，其中50種物質在所有樣品中均檢出，2,5-二甲基-3-丁基吡嗪、三甲基吡嗪和苯乙醇等11種揮發性物質含量豐度較高。統計分析結果表明，較高的吡嗪類物質是茅臺原產曲的重要特征，而源于其他生產域的醬香型大曲中揮發性組分則以酯類為主。馬茹菲等[25]利用SPME-GC-MS研究了不同產地的清香型大曲，共檢出78種揮發性組分，其中醇類、酯類含量較高，揮發性成分豐富的樣品其感官評價也有較為濃郁的曲香。

3 大曲風味物質的分析檢測方法

有關大曲風味物質預處理方法和定性定量方法總結可見表2。

表2 有關大曲風味物質研究預處理方法和定性定量方法總結Table 2 Summary of pretreatment methods,qualitative and quantitative methods of Daqu flavor compounds analysis

續表

3.1 大曲樣品前處理方法

大曲是固體狀態，提取香氣成分的難度比液體狀態的白酒更大。要從固體粉末中提取香氣成分，主要有兩種方法：①直接從樣品的頂空氣體中提取，如HS-SPME等；②將固體樣品轉換為液體樣品，再使用處理液體樣品的方法進行提取，如液液萃取-溶劑輔助風味蒸發（liquid-liquid extraction-solvent assisted flavor evaporation，LLE-SAFE）、同時蒸餾提?。╯imultaneous distillation-extraction，SDE）等。

3.1.1 固相微萃取法

大部分研究人員均采用HS-SPME來對大曲進行預處理。HS-SPME是集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品微萃取技術，操作簡單，攜帶方便，操作費用低，綠色環保。ZHENG J等[9]以不同溫曲階段的五糧液包包曲為研究對象，利用HS-SPME和GC-MS、氣相色譜-火焰離子化檢測器（gas chromatography flame ionization detector，GC-FID）研究了主要揮發性化合物，結果顯示，當溫度升高時，揮發物總含量也增加，在3 d達到最高水平，之后降低，且升溫階段是乙酸和乳酸的產生階段，降溫階段是吡嗪產生階段。3-甲基丁酸乙酯、（E,E）-2,4-己二烯醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、乙酸和丁酸的OAV值較大。

然而，萃取頭的種類、樣品用量、萃取劑的選擇、萃取時間和萃取溫度等萃取條件都會影響SPME的萃取效果，針對以上影響因素，研究人員對萃取條件進行了優化。范文來等[18]以某醬香型大曲為對象，研究了樣品萃取量、超聲波萃取時間以及不同萃取溶劑對萃取效果的影響。張春林等[19，35]以瀘州老窖大曲為對象，分別考察了萃取頭、萃取時間、萃取溫度、樣品用量及萃取方式對萃取效果的影響。郭兆陽等[41]以某清香型大曲為對象，對萃取頭、溶劑、樣品用量、萃取溫度、萃取時間和鹽離子濃度進行了優化。陳美竹[16]以茅臺大曲為研究對象，考察了萃取方式、萃取溫度和萃取時間對萃取效果的影響。孟維一等[23]以芝麻香型白酒大曲為研究對象，對萃取頭、萃取時間、萃取溫度和樣品量進行了優化，其優化結果總結見表3。

表3 HS-SPME提取大曲風味物質效果優化總結Table 3 Summary of the extraction results optimization of Daqu flavor compounds by HS-SPME

3.1.2 溶劑萃取法

溶劑萃取法是風味分析中的經典方法。其操作簡單，回收率高，但樣品使用量大，萃取液在濃縮過程中會損失一部分低沸點的揮發性成分，且有機溶劑毒性嚴重危害人體健康。同時，大曲中富含油脂、色素、蛋白質以及糖類，這些不揮發性物質嚴重影響氣相色譜對揮發性風味化合物的檢測。呂云懷等[39]通過浸提、液液萃取和GC-MS分析了濃、醬、清香三種大曲，共定性了103種揮發性化合物。醬香大曲的風味物質最為復雜，離子豐度也最高，濃香大曲和清香大曲二者相差不是十分明顯。汪玲玲[34]則以5種不同香型的大曲（醬香、濃香、清香、豉香和藥香）和市售梁山大曲為研究對象，利用液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）處理樣品進行氣相色譜-嗅聞儀聯用（gas chromatographyolfactometry，GC-O）分析，HS-SPME和GC-MS對香氣物質進行定性定量，結合聚類分析（cluster analysis，CA）和判別分析（discriminant analysis，DA）對樣品成功進行區分。

3.1.3 溶劑輔助風味蒸發法

溶劑輔助風味蒸發法（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）是一種從復雜食品基質中全面、溫和地分離香氣化合物的方法，1999年由ENGEL W等[45]發明。SAFE系統是由蒸餾裝置和高真空泵的緊湊結合，樣品中的熱敏性揮發性成分損失少，萃取物具有樣品原有的自然風味。這是國際上較為流行的方法，目前已應用在黃酒酒曲[46]、黑麥面包[47]、可可粉[48]、脫脂奶粉[49]和谷物咖啡渣[50]等香氣物質的提取上。ZHENG J等[9]利用LLE-SAFE和GC-O-MS研究了五糧液“包包曲”在溫曲過程中香氣成分的變化，共鑒定出54種香氣活性成分。

3.2 大曲風味物質定性定量方法

目前廣泛應用于風味物質定性分析的方法主要有標準品比對法、保留指數（retention index，RI）法、GC-MS和GC-O等。但大部分關于大曲風味物質的研究，所采用方法均為MS分析進行譜庫對比，且只采用單一色譜柱進行分離，無法對所有化合物進行分離和準確定性，如共流出組分和具有相似質譜圖的同分異構體。在其他樣品的風味化學分析過程中，化合物的定性常采用多種方法相結合：首先采用MS進行譜庫對比初步定性、再通過計算組分在不同極性色譜柱上的保留指數與標準品的進行對比，同時結合聞香中的香氣特征等多種定性方式準確確定該化合物結構[51]。

ZHANG C L等[52]利用HS-SPME和GC-MS分析研究了由瀘州老窖生產的高溫曲和中溫曲，實驗數據與Wiley譜庫和美國國家標準技術研究所（nationalinstituteof standardsand technology，NIST）譜庫相匹配，取當正反匹配度均＞800的鑒定結果；并計算化合物的保留指數（retention index，RI）；部分利用標準化合物進行定性。共鑒定了75種揮發性化合物，其中含量最大的一組是含氮化合物，如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪，其次是醇類。

廣泛應用于食品風味物質定量分析的方法主要有面積百分比定量法、峰高百分比法、歸一化法、外標定量法和內標定量法等。如表2所示，目前關于大曲的定量分析大部分使用的還是單一內標進行半定量，定量結果不夠準確，數據缺乏說服力。近年來，也有采用多種內標對標準曲線進行校正來定量的。ZHENG J等[9]利用內標標準曲線法對五糧液包包曲中的50種風味成分進行了定量分析，同時，采用芐酯衍生化法[53]定量了乙酸、丙酸、丁酸和乳酸四種有機酸。

4 大曲中已檢測到的風味物質

據筆者統計，截至2018年12月，在大曲中已檢測到456種風味物質（見表4）。按照化合物類別進行分類，其中酯類最多，達到94種，其次為醇類（62種）、醛類（43種）、酸類（41種）、吡嗪類（36種）、酮類（34種）、脂肪烴（25種）、其他雜環類（25種）、呋喃類（18種）、含氮類（16種）、酚類（14種）、醚類（11種）、含硫類（10種）、芳香烴（9種）、萜烯類（8種）、內酯類（7種）和縮羰基類（3種）。466種風味物質中定量了336種，其中250種只采用內標法或歸一化法進行定量。從大曲類型來看，高溫曲中已檢測到255種風味物質，其中定量分析了225種；中溫曲中已定性分析了328種風味物質，其中定量分析了237種；低溫曲中已檢測到140種風味物質，其中120種已被定量分析。

表4 大曲中已檢測到的風味物質總結Table 4 Summary of Daqu flavor compounds detected in Daqu

續表

5 展望

曲香是酒香的重要香氣來源，相比于白酒風味成分研究上取得的巨大進展，有關酒曲的研究多還僅僅停留在微生物分析上，對酒曲風味成分的研究仍在初步階段。目前大部分研究都只通過MS譜庫檢索進行化合物定性、內標法進行半定量分析，定性、定量方法不夠準確，尤其是部分非揮發風味物質的存在可靠性存疑，很多風味物質的位置異構體、順反異構體和光學異構體的結構仍需進一步確認。另外，缺少對風味物質香氣活性的研究，哪些物質對曲香具有重要貢獻尚不清楚；如脂肪族烴、芳香烴等通常氣味較弱，對大曲風味貢獻不大。各個廠家、不同陳曲時間生產的大曲有何區別，哪些物質導致了這些差異，目前尚未被科學、系統地認知。建議在今后研究中，借鑒分子感官科學研究方法，用GC-O分析白酒大曲揮發性成分，結合芳香萃取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）等方法確定大曲中主要香氣活性成分；采用雙柱保留指數比對、標準品對比等手段進行準確定性；采用外標標準曲線法、內標標準曲線法或穩定同位素稀釋法（stable isotope dilution assay，SIDA）等方法進行風味物質準確定量。這將有利于深入了解大曲風味的組成及其對白酒香氣的貢獻，為提高大曲質量、改善成酒品質提供數據支撐。