響應面法優化椰漿蛋白發酵飲料發酵工藝

藺志穎，張博文*，李 佳

（西安源森生物科技有限公司，陜西 西安 710000）

椰漿是椰子榨汁后形成的產物，主要用作飲料或烹調的原料[1]。椰漿富含蛋白質、脂肪、礦物質、維生素等營養成分[2-4]，椰子中的脂肪46%為月桂酸，它是中鏈甘油三酯的主要來源，不會增加膽固醇水平、具有抗菌等生理功能[5]。鮮榨椰漿極易受到環境中微生物的污染，致使椰漿產品產氣、膨脹、脹裂罐，故目前市場的椰漿產品主要有冷凍椰漿和滅菌椰漿兩種[6-7]，在產品形式上較為單一。

乳酸菌作為一種常見的發酵菌種，應用在食品加工中起到改善風味，延長產品保質期和增強保健的功能[8]。乳酸食品對人體健康具有調節腸道功能、促進新陳代謝、增強免疫力等功效[9-11]。目前，被廣泛應用于酸奶、發酵飲料、肉制品加工中。

近年來，全球植物蛋白市場增長迅猛，消費者對植物蛋白的需求將持續增長，植物性食品的全球需求量在2013年至2017年間增長了62%[12]。目前市場上大多數為植物蛋白飲料，而在發酵方面研究較少。國內外近些年的研究主要是以奶粉及椰漿為原料，研究發酵椰奶的工藝及發酵過程中營養成分的變化[13]。SHANA R等[14]以椰奶和牛奶混合發酵，研制出感官及性狀較好的印度傳統椰漿酸奶；GARDIOLA A B等[15]研究了不同乳酸菌發酵對椰漿蛋白中氨基酸含量的變化，結果表明，乳酸酸發酵提高了椰子蛋白濃縮物的賴氨酸和蛋氨酸水平。

本研究旨在以椰漿乳原料，通過乳酸菌發酵研制植物基蛋白發酵飲料，并采用單因素及響應面試驗優化其發酵工藝條件，在提高椰漿的利用率的同時，豐富蛋白發酵飲料的種類，提升椰漿乳的營養價值，并為今后椰漿發酵蛋白飲料產品的產業化開發提供工藝指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰漿粉：海南南派實業有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）BB-12、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Strep-tococcus thermophilus）菌粉：江蘇微康生物科技有限公司；白砂糖（食品級）：市售；MRS肉湯培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DUP-9160B智能電熱恒溫培養箱：上?，槴\實驗設備有限公司；BHC-1300IIA/B2無菌操作臺：蘇州凈化設備有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊試驗有限公司醫療設備廠；PHS-3C雷磁pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SLS-60高壓均質機：上海申鹿均質機有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 椰漿蛋白發酵飲料工藝流程

1.3.2 操作要點

椰漿粉按照料水比1∶4（g∶mL）加常溫蒸餾水溶解，加入適量白砂糖及0.05%的穩定劑，將加入配料的原料預熱60℃，采用高壓均質機在15 MPa條件下進行均質，于90℃條件下殺菌15 min，冷卻至45℃后，無菌條件下接種1.5‰乳酸菌菌粉（植物乳桿菌∶雙歧桿菌BB-12∶保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1∶1∶1），在溫度為43 ℃條件下[16]發酵16 h，發酵結束后在4℃條件下后熟12 h。

1.3.3 椰漿蛋白發酵飲料工藝優化單因素試驗

以發酵溫度43℃、接種量（植物乳桿菌∶雙歧桿菌BB-12∶保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1∶1∶1）1.5‰、發酵時間16 h和白砂糖添加量4%為基礎發酵條件，對接種量（0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰）、發酵時間（8 h、12 h、16 h、20 h、24 h）和白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）進行單因素試驗，考察接種量、發酵時間及白砂糖添加量對椰漿蛋白發酵飲料酸度及感官品質的影響。

1.3.4 響應面試驗優化椰漿蛋白發酵飲料發酵工藝

在單因素的基礎上，采用Box-Benhken試驗設計，設置接種量（A）、發酵時間（B）和白砂糖添加量（C）3因素為自變量，以單因素結果為中心點，設3個水平，以發酵產品感官評分（Y）為響應值，進行發酵工藝優化，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Benhken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhken experiments design

1.3.5 分析檢測

（1）總酸

按照GB 541334—2010《乳和乳制品酸度的測定》測定發酵蛋白飲料總酸。

（2）蛋白質

按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》測定發酵蛋白飲料蛋白質含量。

（3）感官評價

選擇10人組成感官評價小組，對椰漿蛋白發酵飲料的色澤、氣味、組織形態及口感進行評價，滿分10分，感官評價標準見表2。

表2 椰漿蛋白發酵飲料感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of coconut milk protein fermented beverage

1.3.6 數據統計與分析

試驗數據采用Design Expert8.0.5進行分析處理，采用Origin 8.0軟件繪圖處理。每組試驗3次平行，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 椰漿蛋白發酵飲料工藝優化單因素試驗

2.1.1 接種量對椰漿蛋白發酵飲料的酸度和感官評價的影響

不同接種量對椰漿蛋白發酵飲料的酸度和感官評價的影響結果見圖1。由圖1可知，接種量為0.5‰時，發酵成熟的樣品酸度僅為47.8°T左右。隨著接種量在0.5‰～2.5‰范圍內的增加，椰漿蛋白發酵飲料酸度呈持續上升的趨勢。在接種量為1.5‰時，酸度達61.3°T；當接種量為2.5‰時，酸度達70.0°T。隨著接種量在0.5‰～2.5‰范圍內的增加，感官評分呈現先上升后下降的趨勢。在接種量為1.5‰時，感官評分最高，達9.0分，酸度適宜。而低接種量條件下，由于菌種產酸量較低，產品酸味不明顯[17]；接種量為2.5‰時，由于產酸量的增加，導致產品酸味過于明顯，掩蓋了本身的椰奶風味，使得在感官上接受度降低[18]，綜合感官評分僅為7.1分。綜合接種量對產品酸度及感官評分的影響，選擇接種量為1.5‰。

圖1 接種量對椰漿蛋白發酵飲料酸度及感官評價的影響Fig.1 Effects of inoculum on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

2.1.2 發酵時間對椰漿蛋白發酵飲料的酸度和感官評價的影響

不同發酵時間對椰漿蛋白發酵飲料的酸度和感官評價的影響結果見圖2。由圖2可知，發酵時間對酸度影響較大，隨著發酵時間在8～24 h范圍內的延長，菌種持續產酸，使得產品酸度呈上升趨勢。發酵8 h時，酸度僅為30.1°T；而發酵24h后，酸度達67.2°T，約為發酵8 h產品酸度的2倍。隨著發酵時間在8～24 h范圍內的延長，感官評分呈先上升后下降的趨勢。發酵時間＜12 h之前，由于乳酸積累較少，使得產品發酵酸味不明顯，導致評分較低。而隨著發酵的進行，乳酸積累，產品發酵酸味提升，甜酸適宜，在發酵20 h時，感官評分最高，達到8.3分。隨著發酵時間的進一步延長，酸度積累過高導致風味過酸，且發酵時間過長導致乳清析出，并導致評分呈現下降趨勢[19-20]。

圖2 發酵時間對椰漿蛋白發酵飲料酸度及感官評價的影響Fig.2 Effects of fermentation time on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

綜合發酵時間對產品酸度及感官評分的影響，選擇發酵時間為20 h。

2.1.3 白砂糖添加量對椰漿蛋白發酵飲料的酸度和感官評價的影響

不同白砂糖添加量對椰漿蛋白發酵飲料的酸度和感官評價的影響結果見圖3。由圖3可知，白砂糖添加量對椰漿蛋白發酵飲料的酸度影響較小，發酵成熟后酸度含量差異不明顯，成品酸度均在63°T左右。隨著白砂糖添加量在2%～6%范圍內的增加，感官評分呈先上升后下降趨勢，白砂糖添加量較少時，發酵飲料酸味較明顯，且風味上醋酸味明顯，感官評分僅為7.1分；白砂糖添加量為4%時，感官評分最高為8.9分；白砂糖添加量＞4%之后，會影響菌種的生長，導致產品在組織形態上表現出少量乳清析出的狀態，且口感過甜無法接受[21]。

圖3 白砂糖添加量對椰漿蛋白發酵飲料酸度及感官評價的影響Fig.3 Effects of sugar addition on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

綜合白砂糖添加量對產品酸度及感官評分的影響，選擇白砂糖添加量為4%。

2.2 響應面優化椰漿蛋白發酵飲料工藝

2.2.1 回歸方程建立與方差分析

根據單因素試驗結果，以接種量（A）、發酵時間（B）及白砂糖添加量（C）為自變量，感官評分（Y）為因變量進行響應面試驗，Box-Benhken試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Box-Benhken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Benhken experiments

續表

采用Design Expert 8.0.5軟件對表4數據進行二次回歸方程擬合，得到感官評分（Y）對接種量（A）、發酵時間（B）及白砂糖添加量（C）的二次多項回歸方程：

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型極顯著（P=0.000 2＜0.01），失擬項不顯著（P=0.123 4＞0.05）?；貧w模型的決定系數R2=0.97，說明該模型能夠很好地描述試驗結果。變異系數（coefficient of variation，CV）為89%，說明模型的準確度及可靠性較高[22]。從表4中P值和回歸方程中各因素的一次項系數的絕對值大小可知，影響椰漿蛋白發酵飲料感官評價因素主次順序為白砂糖添加量＞接種量＞發酵時間[23]。一次項C及交互項BC對產品感官評分的影響達到顯著水平（P＜0.05），二次項A2、B2及C2對產品感官評分的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。

2.2.2 各因素響應面交互作用分析

采用Design Expert8.0.5軟件對影響椰漿蛋白發酵飲料的3個因素進行交互分析，結果見圖4。

圖4 接種量、發酵時間和白砂糖添加量對椰漿蛋白發酵飲料感官評價影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum，fermentation time and sugar addition on sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

由圖4可知，等高線的形狀反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[24]。接種量固定不變，椰漿蛋白發酵飲料的感官評價隨發酵時間增加，呈現先增加后減少的趨勢；發酵時間不變，感官評價隨乳酸菌接種量的增加先急劇增大后明顯減小。乳酸菌接種量固定不變，感官評價隨白砂糖添加量的增加，呈現先增加后減少的趨勢；白砂糖添加量不變，椰漿蛋白發酵飲料的感官評價隨接種量的增加，增大并在后面呈下降趨勢。固定發酵時間，感官評分隨白砂糖添加量的增加急劇增大后略有下降，白砂糖添加量不變，感官評分隨發酵時間的增加，變化不明顯。

2.2.3 最優發酵條件的確定及驗證

根據多元二次回歸方程，得到最優發酵條件為乳酸菌接種量1.00‰，白砂糖添加量3.95%，發酵時間20.5 h，得到的產品感官評分理論值為9.39分。為了便于實際操作，將發酵工藝條件修改為接種量1.00‰，白砂糖添加量4.0%，發酵時間20 h，根據此條件進行驗證試驗，得到的產品感官評分實際值達9.37分，酸度63°T，蛋白含量1.1 g/100 mL。其中感官評分與理論值差別不大，說明該模型能夠較好地模擬和預測試驗結果。

3 結論

通過單因素試驗對接種量、發酵時間和白砂糖添加量進行優化，利用響應面優化椰漿蛋白發酵飲料工藝參數。最優發酵工藝條件為將乳酸菌按植物乳桿菌∶雙歧桿菌BB-12∶保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1∶1∶1的比例接種于添加了4.0%白砂糖的椰漿中，接種量為1.00‰，43℃條件下發酵20 h。在此發酵條件下，椰漿蛋白發酵飲料感官評分達9.37分，酸度63 °T，蛋白含量1.1 g/100 mL，符合國家農業行業標準NY/T 433—2014《綠色食品植物蛋白飲料》要求，色澤乳白，具有椰奶香味及發酵特有的風味，是一款老少咸宜的植物基蛋白發酵飲料。