新疆、內蒙古地區馬乳及發酵酸馬乳中氨基酸分析與營養評價

郭琳儀，孫慧陽，馬 潔，王海燕，吳小勇，朱林生，耿 煒，葛武鵬,*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.咸陽市食品藥品檢測檢驗中心，陜西 咸陽 712000；3.陜西飛天乳業有限公司，陜西 寶雞 721100；4.咸陽市產品質量監督檢驗所，陜西 咸陽 712000）

乳是一種生理和營養均衡的乳腺分泌物，通過乳腺中血液的合成及擴散過程形成，具有較高的熱值[1]，含有人體所需的多種營養素。近年來，人們對乳品的營養要求越來越高，馬乳因特色鮮明、營養豐富、資源稀有漸受青睞。

劉亞東等[2]研究發現，馬乳可能具有更高的營養價值和更合理的氨基酸模式，且相對于其他乳制品，馬乳制品一些結構和功能上的特性使其更符合人們的營養需要，馬乳制品的乳糖含量高于其他乳制品，更利于腸道微生物的生長，改善腸道問題[3]。馬乳營養組成與人乳非常接近[4]，馬乳中含有約40%的乳清蛋白，比人乳約高50%，富含必需氨基酸（essential amino acid，EAA）。由于磷脂含量高，馬乳對慢性肝炎和胃潰瘍的治療比牛乳更有效，馬乳還可以治療貧血、腎炎、痢疾等疾病，有助于術后康復[5]。酸馬乳是牧民以鮮馬乳為原料，采用傳統發酵過程，經乳酸菌和酵母菌共同自然發酵釀制而成，酸馬乳具有獨特的風味和口感。發酵過程中添加的配料及微生物代謝產物，如肽類、殺菌物質、維生素、n-3系列脂肪酸、有機酸、CO2、乙醇、芳香物質和大量活性物質會刺激免疫系統，增強抗菌活性[6]，因此酸馬乳更具營養與保健價值。

馬子紅等[7]提出，人民生活水平不斷提升的同時，我國乳制品產業步入快速發展階段，呈現出生產規模不斷擴大、產品類型日益多樣、市場結構趨于穩定等特征。新疆、內蒙古是我國多民族聚居地和養馬大省，馬乳資源豐富。維吾爾族、哈薩克族、蒙古族等少數民族居民素有飲用馬乳和酸馬乳的傳統。馬乳及酸馬乳是牧民攝取營養的主要來源之一，并且由于其獨特的品質和功能，馬乳在輔助疾病治療及應用于食品行業方面具有巨大潛力。但是，由于受到經濟條件、傳統觀念、地域條件和生產水平等因素的制約，當前對馬乳及傳統發酵酸馬乳的相關營養價值研究與開發一直未得到重視，此類天然綠色乳品的開發利用仍處于初級階段。

本研究對新疆和內蒙古主產區的馬乳及酸馬乳中的氨基酸組成進行差異性分析。依據聯合國糧農組織/世界衛生組織（United Nations Food Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）提出的氨基酸評分模式和全雞蛋蛋白模式，計算氨基酸評分（amino acid scoring，AAS）、化學評分（chemical score，CS）和必需氨基酸指數（essential amino acid index，EAAI），評價新疆、內蒙古兩地馬乳及酸馬乳的蛋白質營養價值，探討地域、發酵因素對馬乳中氨基酸含量的影響，為馬乳制品的開發與利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

2016年8月，在新疆、內蒙古代表性地區采集乳樣共40 份。其中，新疆牧區鮮馬乳10 份，酸馬乳10 份，內蒙古牧區鮮馬乳10 份，酸馬乳10 份。人工采集乳樣后，裝入干凈的取樣瓶中，密封并用干冰迅速冷卻，在冰盒內4 ℃冷藏運至實驗室，凍藏于－80 ℃冰箱備用。

1.1.2 試劑

17 種氨基酸標準混合物、氨基酸補充劑盒 美國安捷倫科技有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、9-芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl）、3-巰基丙酸、1-辛醇、重蒸苯酚、氫氧化鈉、硼酸、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸（均為分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Tedia公司；濃鹽酸（分析純） 西安化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

S-433D氨基酸全自動分析儀、LCAK06/Na磺酸基強酸性陽離子交換樹脂色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）德國Skykam公司；Aglient 1100高效液相色譜儀、Poroshell HPH-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）、Poroshell HPH-C18色譜柱保護柱（4.6 mm×5 mm，2.7 μm） 美國安捷倫科技有限公司；HC3018高速離心機 安徽科大中佳有限公司；PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；AUY220電子精密天平 日本島津公司；DHP-140電熱恒溫干燥箱 中儀國科（北京）科技有限公司；MD200-1氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游離氨基酸的測定

樣品前處理：取1 g樣品于2 mL離心管，4 ℃條件下以10 000×g離心15 min脫脂，取600 μL上清液，加入200 μL的10 g/100 mL磺基水楊酸水溶液，沉淀蛋白質，靜置1 h左右待蛋白質沉淀完全后，4 ℃條件下以10 000×g離心15 min，收集上清液，過0.22 μm濾膜準備上機檢測。

色譜條件：色譜柱LCAK06/Na（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A：檸檬酸鈉（0.12 N（當量濃度），pH 3.45）；流動相B：檸檬酸鈉（0.2 N，pH 10.85）；流速：洗脫泵0.45 mL/min，衍生泵0.25 mL/min；檢測波長：440 nm（脯氨酸）和570 nm（其余氨基酸）；進樣量25 μL；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 游離氨基酸梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for free amino acids

1.3.2 16 種水解氨基酸的測定

參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》，并稍做修改。

樣品前處理：取乳樣200～400 mg（精確至0.000 1 g），置于水解管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，滴加3～4 滴質量分數5%重蒸苯酚溶液，立即放入冷凍劑中冰浴3～5 min，于管口吹氮15 min鉗蓋封口；水解管溫度（110±1） ℃，高溫水解22 h，冷卻至室溫；開管，過濾水解液至50 mL容量瓶，少量多次水洗水解管，轉移、定容、混勻；準確吸取1.0 mL濾液至5 mL氮吹管，氮氣吹干后，殘留物用0.5 mL水溶解，再次吹干，反復2～3 次；最后用1.0 mL水溶解殘留樣品，過0.22 μm濾膜。

衍生：采用安捷倫液相Poroshell HPH-C18OPA-Fmoc在線衍生程序。

色譜條件：色譜柱Poroshell HPH-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫40 ℃，流速1.5 mL/min；流動相A：含10 mmol/L磷酸氫二鈉、10 mmol/L硼酸鈉的緩沖溶液，用鹽酸調pH值至8.2；流動相B：甲醇、乙腈、水體積比45∶45∶10；梯度洗脫程序如表2所示。

表2 水解氨基酸梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for hydrolyzed amino acids

檢測條件：波長338 nm，帶寬10 nm，參比390 nm，帶寬20 nm（一級氨基酸）；波長262 nm，帶寬16 nm，參比324 nm，帶寬8 nm（二級氨基酸）；于賴氨酸出峰后切換波長至262 nm。

1.3.3 色氨酸的測定

參照AOAC 988.15《食品和飼料中色氨酸的測定》，并稍做修改。水解管中加入10 mL脫氣的4.2 mol/L NaOH（使用前高純氮氣鼓泡10 min），滴加3 滴1-辛醇，立即置于水解管，于干冰-乙醇浴中冷凍處理，以凍住為宜；充入高純氮氣，于管口吹氮15 min鉗蓋封口；降至室溫，待樣品全部融化，置密封的水解管于烘箱中，（110±1） ℃水解處理20 h，冷卻至室溫；轉移水解液至50 mL燒杯，加入濃鹽酸，劇烈攪拌，調節水解液pH值至4.25±0.05；將水解液轉移至25 mL容量瓶，少量多次水洗水解管，轉移、定容、混勻；轉移水解液至50 mL離心管，1 150×g離心20 min；濾紙（Whatman GF/A）過濾上清液，轉移濾液至離心管，15 000×g離心10 min；取上清液混勻，過0.22 μm濾膜。衍生與色譜條件同1.3.2節。

1.3.4 氨基酸營養評價方法

根據FAO/WHO在1973年建議的AAS標準模式和全雞蛋蛋白質的氨基酸模式，分別按照公式（1）～（3）計算AAS、CS和EAAI[8-9]。

式中：aa為被測樣品氨基酸含量/（mg/g）；AA（FAO/WHO）為FAO/WHO評分標準模式中同種氨基酸含量/（mg/g）；AA（EGG）為全雞蛋蛋白質中同種氨基酸含量/（mg/g）；n為比較的必需氨基酸種類；Ai為乳樣中必需氨基酸含量/（mg/g）；Bi為FAO標準中必需氨基酸含量/（mg/g）。

1.4 數據處理

同一樣品連續測定2 次，取平均值。采用Minitab 16.2.3和Excel 2007軟件進行統計分析，結果均以平均值±2×標準差表示，采用Fisher法進行多重比較，顯著性水平設定為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 馬乳及酸馬乳氨基酸含量比較

2.1.1 游離氨基酸

表3 新疆、內蒙古地區馬乳及酸馬乳中游離氨基酸含量Table 3 Free amino acid contents of fresh and fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia mg/mL

由表3可知：新疆、內蒙古馬乳中均共檢出29 種游離氨基酸，總量分別為30.42、72.94 mg/mL；新疆酸馬乳共檢出32 種游離氨基酸，總量為109.74 mg/mL，內蒙古酸馬乳共檢出36 種游離氨基酸，總量為199.33 mg/mL；9 種EAA中Lys含量最高，10 種非必需氨基酸（nonessential acid，NEAA）中Asn含量最高，17 種非蛋白質編碼氨基酸中磷-絲氨酸（P-Ser）含量最高，P-Ser具有提高老年人記憶、治療老年癡呆的作用[10]。

新疆、內蒙古兩地馬乳經發酵后，游離氨基酸含量分別升高79.32、126.39 mg/mL，新疆、內蒙古馬乳中Lys含量分別為4.82、5.04 mg/mL，發酵后Lys含量顯著升高，分別為22.92、23.88 mg/mL，飲用高含量Lys乳對機體增加體質量和身高具有明顯作用[11]。新疆地區馬乳中除Thr、Ser、Tau、Orn、Hyp、Cit、3-Mhis、1-Mhis、Abu、Car、Ans外，其余游離氨基酸含量在發酵后顯著升高（P＜0.05）。內蒙古馬乳發酵后除Thr、Met、Tau、Orn、Hylys、1-Mhis、Car、Ans外，其余游離氨基酸含量均顯著升高（P＜0.05）。新疆、內蒙古馬乳經發酵后，GABA、β-丙氨酸（β-Ala）含量均顯著升高，GABA可顯著提高免疫力，并具有抗氧化、降血壓、抗焦慮等功能[12-14]，β-丙氨酸（β-Ala）具有抗癌、改善小腸損傷、抗氧化、增強運動能力等功能[15-18]，說明發酵過程中微生物在促進蛋白質降解、氨基酸釋放的同時，也參與了大量具有活性的特殊氨基酸的生物轉化生成過程[19]。

2.1.2 水解氨基酸

表4 新疆、內蒙古地區馬乳及酸馬乳中水解氨基酸含量Table 4 Hydrolyzed amino acid contents of fresh and fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia mg/mL

由表4可知：新疆、內蒙古地區馬乳及酸馬乳中含量最高的水解氨基酸均為Glu，Glu是谷胱甘肽的前體，是重要細胞組分和遞質，在一些傳染病中，Glu的供應與死亡率和發病率呈負相關[4]；9 種EAA中，含量最高者為Leu，其次為Lys、Val和IIe，這與高玎玲等[20]研究結果一致，Leu有助于睡眠、降低痛感、緩和焦躁及緊張情緒；內蒙古鮮馬乳中His、Pro含量顯著高于新疆馬乳（P＜0.05），但TAA無顯著差異（P＞0.05）；內蒙古酸馬乳較內蒙古鮮馬乳，EAA、TAA、DAA、BCAA含量均升高，但無顯著差異（P＞0.05）；新疆、內蒙古酸馬乳的EAA、NEAA、TAA均具有顯著差異（P＜0.05）。

乳中氨基酸的營養價值不僅與氨基酸含量有關，同時與蛋白質質量密切相關。盡管新疆、內蒙古馬乳和酸馬乳中氨基酸含量不同，但乳樣各氨基酸在TAA中占比整體相近。乳中DAA含量與EAA的變化趨勢相同，新疆、內蒙古地區馬乳及發酵酸馬乳DAA/TAA均大于60%，有利于食用者滋補和增強免疫力[22]；兩地馬乳及發酵酸馬乳EAA/TAA接近40%，EAA/NEAA均大于60%，符合FAO/WHO理想蛋白質推薦標準；BCAA/TAA均接近20%，BCAA能更快地分解轉化為葡萄糖，防止肌肉損失，促進運動后的肌肉恢復，特別適用于健美運動員[23-24]。以上結果表明，新疆、內蒙古地區馬乳及發酵酸馬乳為優質蛋白源。

新疆馬乳樣品主要采自哈密巴里坤縣和伊犁伊寧縣，來自巴里坤馬等優良品種，而內蒙古乳樣多來自內蒙馬和內蒙改良馬[25]，遺傳基因是乳中氨基酸組分及含量具有差異的主要因素，同時還受到飼養方式、泌乳期、環境等因素的影響[26]。不同地區酸馬乳制品中存在著復雜多樣的乳酸菌菌群及微生態結構，與發酵時間、采樣時間及采樣點有關[27]。以上均為新疆、內蒙古地區馬乳及酸馬乳氨基酸組成及含量產生差異的原因。

2.1.3 呈味氨基酸

表5 新疆、內蒙古地區馬乳及酸馬乳中呈味氨基酸占總氨基酸百分比Table 5 Taste-active amino acid contents of fresh and fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia%

對鮮馬乳和酸馬乳中鮮味、甜味和芳香族3 類味覺氨基酸[28]進行分析。由表5可知：2 個地區的鮮馬乳和酸馬乳中富含鮮味氨基酸、甜味氨基酸，其中內蒙古馬乳中的鮮味、甜味氨基酸含量分別為32.46%和20.31%，均高于新疆馬乳（32.12%和19.36%），但內蒙古馬乳中的芳香族氨基酸含量（8.12%）略低于新疆馬乳（8.75%），綜合分析得到，內蒙古馬乳風味更鮮甜；新疆馬乳經發酵后甜味氨基酸含量明顯升高，且新疆酸馬乳呈味氨基酸總含量高于鮮馬乳，說明發酵對馬乳風味有提升作用。

2.2 馬乳及酸馬乳的氨基酸營養價值評價

食物蛋白質氨基酸模式與人體氨基酸模式擬合度越大，必需氨基酸利用率越高，蛋白質營養價值越高[29]，AAS常用來評價食物的氨基酸實用價值。AAS指待測蛋白質中某一必需氨基酸占WHO/FAO評分模式中相應氨基酸含量的百分比，它反映了食物蛋白質與人體蛋白質構成模式的接近程度。CS用于評價待測蛋白質中某一必需氨基酸的相對含量與標準卵清蛋白中相應必需氨基酸相對含量的接近程度，AAS、CS值越接近1，分別說明與標準模式氨基酸組成、標準雞蛋蛋白質的組成越接近，營養價值就越高[30]。EAAI反映蛋白質源的必需氨基酸與標準蛋白質必需氨基酸組成的擬合程度[2]，乳中氨基酸越接近人體所需氨基酸的比例，其生物學價值越高。

表6 新疆、內蒙古馬乳及酸馬乳的必需氨基酸組成與不同推薦模式值的比較Table 6 Comparison of essential amino acid composition of fresh and fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia with different recommended pattern values%

由表6可知，馬乳及酸馬乳必需氨基酸種類齊全、含量充足。內蒙古酸馬乳除Met＋Cys外，其他氨基酸占總氨基酸的質量分數均高于FAO/WHO的推薦值；新疆與內蒙古馬乳除Met＋Cys外，僅Thr含量略低于FAO/WHO的推薦值；新疆、內蒙古馬乳及酸馬乳中Leu占總氨基酸的質量分數均高于全雞蛋蛋白質的氨基酸模式值，新疆馬乳、內蒙古馬乳、新疆酸馬乳中的Trp和新疆馬乳、內蒙古酸馬乳中的Lys占總氨基酸的質量分數均高于全雞蛋蛋白質的氨基酸模式值；兩地馬乳及酸馬乳蛋白質中必需氨基酸的含量和模式有一定差別。

由表7可知：新疆、內蒙古馬乳及酸馬乳的EAAI均大于95，說明兩地馬乳及酸馬乳均為優質蛋白質資源；Met＋Cys為新疆、內蒙古馬乳及酸馬乳的第一限制氨基酸；新疆酸馬乳EAAI高于新疆鮮馬乳；新疆馬乳和內蒙古馬乳除Met＋Cys、Thr外，其余必需氨基酸的AAS均大于1%，內蒙古酸馬乳除Met＋Cys外，其余必需氨基酸的AAS均大于1%；新疆酸馬乳Leu、Ile、Phe＋Tyr、Thr、Trp的AAS、CS評分均高于新疆馬乳，內蒙古酸馬乳除Leu、Phe＋Tyr、Trp外，其他必需氨基酸的AAS、CS評分均高于內蒙古馬乳，說明發酵提升了新疆、內蒙古兩地馬乳的營養價值。

表7 新疆、內蒙古馬乳及酸馬乳的氨基酸評價Table 7 Amino acid evaluation of fresh and traditional fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia

3 結 論

新疆、內蒙古兩地馬乳及酸馬乳中游離和水解氨基酸種類豐富、數量充足。新疆、內蒙古地區馬乳中氨基酸總量無顯著差異（P＞0.05），酸馬乳中游離氨基酸含量普遍高于相應鮮馬乳，同時發酵過程中生成β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、β-氨基異丁酸、高胱氨酸等具有生理活性的特殊氨基酸；新疆酸馬乳較鮮馬乳含有更多的甜味氨基酸、芳香族氨基酸，味道更佳；新疆、內蒙古馬乳及酸馬乳的EAAI均大于95，表明新疆、內蒙古馬乳及酸馬乳均為優質蛋白質源；新疆酸馬乳EAAI高于新疆鮮馬乳，內蒙古酸馬乳除Leu、Phe＋Tyr、Trp外，其他必需氨基酸的AAS、CS評分均高于內蒙古鮮馬乳。綜上，相比新疆、內蒙古鮮馬乳，酸馬乳具有更高的營養價值。