響應面法優化青豆蛋白提取工藝

張悅，劉振春，彭雪，周瑾琨

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130000）

青豆（green bean）為豆科大豆屬一年生草本植物，原產中國[1]。中國自古栽培，至今已有5000年的種植史?，F在全國普遍種植，在東北、華北、陜、川及長江下游地區均有出產，以長江流域及西南栽培較多，以東北青豆質量最優。青豆中富含蛋白質和纖維素及多種抗氧化成分，還能消除炎癥[2]。青豆可以為人體提供兒茶素以及表兒茶素兩種類黃酮抗氧化劑，這兩種物質能夠有效去除體內自由基，預防由自由基引起的疾病，延緩身體衰老速度，還有消炎抗菌的作用。青豆蛋白是一種植物性蛋白質。青豆蛋白的氨基酸組成與牛奶蛋白質相近[3]，除蛋氨酸略低外，其他與動物蛋白質近，在基因結構上也是最接近人體氨基酸，所以是最具營養的植物蛋白質。青豆蛋白含量約為38%以上，是谷類食物的 4 倍～5 倍。FAO/WHO（1985）人類試驗結果表明，青豆蛋白必需氨基酸組成較為適合人體需要，對于兩歲以上的人，青豆蛋白的生理效價為100[4-6]。人體對蛋白質的需求因年齡、性別、體重、工種等不同而有所差異，為了指導人們的膳食，世界各國結合本國的情況分別制定出“推薦每日膳食營養素供給量”（recommended daily allowance，RDA）。1999年，美國食品藥品監督局（Food and Drug Administration，FDA）發表聲明：每天攝入25 g 克蛋白質，有減少患心腦血管疾病的風險[7]。

青豆具有降低血液中的膽固醇，及補肝養胃、滋陰強壯、有助于長筋骨、悅顏面、烏發明目、延年益壽等功效[8-9]。更年期婦女、糖尿病和心血管病患者最適宜吃青豆。青豆對腦力工作者和減肥者也非常合適[10]?，F代人群所需要的食品應該是既能引起食欲，又無不良副作用，而且含有豐富營養。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青豆：吉林省舒蘭市；青豆蛋白：吉林農業大學糧油實驗室自提。

氫氧化鈉、鹽酸、石油醚、溴化鉀、磷酸：北京化工廠；考馬斯亮藍G250：天津瑞金特化學品廠。

1.2 儀器與設備

FA1004A 電子天平、JY92-2ⅡDN 超聲波細胞粉碎機：上海精天電子儀器有限公司；LXJ-ⅡB 冷凍離心機：寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-9140ME數顯鼓風干燥箱：上海安亭科學儀器廠；HH-2 數顯恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DY-40電動粉末壓片機：常州澳華儀器有限公司；PHS-3C 精密pH 計：天津市科器高新技術公司；FD-1 型冷凍干燥機：上海日島科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 蛋白質等電點的測定

青豆蛋白的等電點測定，采用沉淀質量法：稱取青豆粉（過 80 目篩）30 g，在 1∶20（g/mL）、45 ℃條件下，用 1 mol/L 的 NaOH 調節溶液 pH 值至 9.5，攪拌提取 30 min，5 000 r/min 離心 10 min，取上清液，平均分成6 份，用1 mol/L HCl 調節溶液pH 值分別為4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，靜置 1 h，5 000 r/min 離心 10 min，去除上清液，測定沉淀蛋白質的質量，從而確定其等電點。

1.3.3 堿溶酸沉法提取青豆蛋白

將干燥的青豆粉碎過80 目篩，稱取5 g 青豆粉，按料液比為 1∶20（g/mL）攪拌 15 min，放入 45 ℃水浴鍋中加熱1 h，用1 mol/L 的NaOH 調節溶液pH 值為9.5，靜置 15 min 后 5 000 r/min 離心 10 min，取上清液，用1 mol/L 的HCl 調節溶液pH 值為4.4，靜置30 min后5 000 r/min 離心10 min，取沉淀，冷凍干燥。

1.3.4 超聲波輔助法提取青豆蛋白

將青豆粉按照料液比為 1∶20（g/mL）混合，超聲功率500 W，超聲30 min 后，按照1.3.1 試驗方法進行操作。

1.3.5 超聲波輔助法提取青豆蛋白單因素試驗

根據預試驗和文獻[11-13]，固定其它因素考核某一因素的變化情況，進行以下單因素試驗。

1.3.5.1 料液比對青豆蛋白提取率的影響

超聲時間30 min、超聲功率500 W。料液比分別取1∶18、1∶20、1∶22、1∶24、1∶26、1∶28、1∶30（g/mL），考察料液比對青豆蛋白提取率的影響。

1.3.5.2 超聲時間對青豆蛋白得率的影響

料液比 1∶22（g/mL）、超聲功率 500 W。超聲時間取 10、20、30、40、50、60 min，考察超聲時間對青豆蛋白提取率的影響。

1.3.5.3 超聲功率對青豆蛋白得率的影響

料液比 1∶22（g/mL）、超聲時間 30 min。超聲功率取為 100、200、300、400、500、600、700 W，考察超聲功率對青豆蛋白得率的影響。

1.3.6 響應面法優化試驗

選取最佳方案，在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理，選取3 個變量，采用響應面分析法對其進行優化，以得率為考察值，設計三因素三水平的響應面試驗。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 The factors and level of response surface method

2 結果與分析

2.1 青豆蛋白最佳等電點的選擇

不同pH 值條件下青豆蛋白沉淀的質量變化見圖1。

圖1 不同pH 值下蛋白得率的比較Fig.1 Comparison of protein yield at different pH values

在pH 值為9.5 時，以青豆蛋白質沉淀質量為指標，分別考察不同pH 值條件下青豆蛋白質沉淀的質量，在pH4.4 處青豆蛋白質沉淀最多，這主要是由于蛋白質肽鍵脫水縮合，某些氨基酸的殘基電離，使得蛋白質分子所帶的靜電荷隨溶液pH 值的變化而變化，根據等電點蛋白質溶解度最小的原理，測得青豆蛋白的等電點為pH 4.4，蛋白質所含氨基酸的種類和數量是特定的[14]。

2.2 超聲波輔助法與堿溶酸沉法制備青豆蛋白提取率和純度的比較

通過凱氏定氮法測定所提青豆蛋白的純度，超聲波輔助法提取青豆蛋白的得率為41.90 %，純度為73.56%，堿溶酸沉法提取青豆蛋白得率為29.78%，純度為86.42%，對比可得，在傳統堿溶酸沉方法的基礎上，利用超聲波進行預處理，雖然超聲波輔助法的純度較傳統方法略低，但提取率大大提高，說明超聲波輔助法對青豆蛋白的提取有一定的優化作用。

2.3 預處理對青豆蛋白得率的影響

經過石油醚脫脂處理后青豆蛋白的得率為45.72 %，未經處理的青豆粉末，青豆蛋白的得率僅為37.85%，通過對比發現，這可能是因為青豆中含有的脂溶性物質影響了有效成分的溶出[15]，所以，提取前務必要對原料進行脫脂處理。

2.4 超聲波輔助法提取青豆蛋白單因素試驗結果

2.4.1 料液比對青豆蛋白得率的影響

料液比對青豆蛋白得率的影響見圖2。

圖2 料液比對青豆蛋白得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of green bean protein

由圖2 可知，隨著料液比的變化，蛋白質水解度呈現先上升后趨于平緩趨勢，當料液比為1∶20（g/mL）時，青豆蛋白得率達到最大值，并逐漸趨于平緩只是因為隨著溶液體積的增加，蛋白質的溶解度增大。但是當增加到一定程度，青豆蛋白得率不再發生變化，這可能是因為蒸餾水量過多導致青豆蛋白濃度過低[16]，因此體系的料液比為1∶20（g/mL）時所得的青豆蛋白得率最高，所以選擇料液比為 1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）作為響應面的水平。

2.4.2 超聲時間對青豆蛋白得率的影響

超聲時間對青豆蛋白得率的影響見圖3。

圖3 對青豆蛋白得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on yield of green bean protein

由圖3 可知，隨超聲時間的增加，青豆蛋白質分子在堿溶液中溶解度不斷增加，最終到達一個平衡值，幾乎不再發生變化，這是因為超聲時間增加，蛋白質的溶出和擴散速度都不斷增加，表現為青豆蛋白質分子在體系中的溶解不斷增加，當時間大于30 min，整體處于平衡狀態，體系組分不再溶出。因此，超聲時間30 min 較為適宜。

2.4.3 超聲功率對青豆蛋白得率的影響

超聲功率對青豆蛋白得率的影響見圖4。

圖4 對青豆蛋白得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of green bean protein

如圖4 所示，當料液比為 1∶20（g/mL），超聲時間30 min，隨超聲功率增加，青豆蛋白得率逐漸增加，最好趨于平緩，這是由于超聲功率增大，可產生強烈空化、微擾、界面等效應、從而提高了蛋白質分子的質量傳遞能力。當超聲波強度達到或超過空化閥聲壓[17]，此時空化作用明顯，青豆蛋白質得率增加，并且蛋白質溶出量遠遠超過其他雜質，表現為蛋白質得率增加[18]。因此，超聲功率500 W 為適宜。

2.5 響應面法優化超聲波輔助法提取青豆蛋白的工藝

2.5.1 響應面試驗結果

用得率作為試驗的響應值，根據單因素試驗結果，選取對青豆蛋白得率影響較大的3 個因素，即超聲時間（A）、超聲功率（B）、料液比（C），利用 Box-Benhnken響應面分析法設計三因素三水平試驗，結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 超聲波輔助法提取青豆蛋白的響應面設計及試驗結果Table 2 The response surface design and test results were obtained by ultrasonic method

表3 超聲波輔助法提取青豆蛋白回歸方程的方差分析Table 3 An analysis of the variance of the regression equation of green bean protein by ultrasonography

續表3 超聲波輔助法提取青豆蛋白回歸方程的方差分析Continue table 3 An analysis of the variance of the regression equation of green bean protein by ultrasonography

根據Box-Benhnke 中心組合設計原理，以青豆蛋白得率為響應值，利用Design-Expert8.06 對數據實施分析，經因素回歸擬合，得到二次回歸方程：

Y=45.13-0.27A-0.35B+0.11C+0.055AB+0.18AC+0.25BC-0.59A2-0.83B2-0.35C2

由表3 回歸模型方差分析可得，此模型是極顯著的（p＜0.001）。該回歸模型的決定系數為 R2=0.989 9，校正決定系數 R2Adj=0.991 4，失擬項 p=0.364 1＞0.05，不顯著，說明回歸方程擬合程度良好，自變量與響應面之間線性關系顯著，可用于青豆中蛋白提取效果的理論預測。模型中一次項 A、B、C，二次項 A2、B2、C2以及交互項AC、BC 表現為差異極顯著，其余項差異均不顯著。根據表3 可得3 個因素對蛋白得率的影響程度依次為：B＞A＞C，即超聲功率＞超聲時間＞料液比。

2.5.2 響應面及等高線分析

超聲波輔助法提取青豆蛋白響應面及等高線分析見圖5。

圖5 各因素交互作用響應面及等高線圖Fig.5 Interaction response surface and contour map of various factors

各因素之間的相互作用對青豆中提取出的青豆蛋白得率的影響可以由響應面及等高線反映出來。根據圖6 可以得到，超聲時間（B）對料液比（C）交互作用對青豆蛋白得率影響極顯著，超聲功率（A）對料液比（C）交互作用顯著，超聲功率（A）對超聲時間（B）交互作用比較明顯之外，剩下的交互項均不顯著（影響不顯著的交互作用響應面圖未列出）。交互作用不顯著可能是因素的主效應在起作用。曲線的走勢越發明顯的陡峭，說明對于青豆蛋白的得率此因素影響越大；曲線的走勢越發平緩，表明青豆蛋白得率受此因素影響較小。研究結果表明，對青豆蛋白得率影響最大的是超聲時間，其次是超聲功率和液料比，這與表3 中回歸分析結果是一致的。超聲時間與超聲功率對青豆蛋白得率的影響達到了極顯著水平（p＜0.001），液料比對應的p 值小于0.05，達到了顯著水平。

2.5.4 最佳制備條件的確定及驗證

通過Design-Expert8.06 軟件對回歸方程的優化計算，并結合實際操作，得到以青豆以初始原料提取青豆蛋白的最佳條件為：料液比為1∶20（g/mL），超聲功率為470 W，超聲時間為27 min。按上述最佳條件進行3 次驗證試驗得到青豆蛋白平均得率為40.98%，純度為73.65%，這與預測的青豆蛋白質得率41.90%十分接近，說明回歸模型可以很好的反映提取青豆蛋白的最佳工藝。

2.6 提取物的鑒定

2.6.1 考馬斯亮藍試驗

通過考馬斯亮藍試驗得到結論，青豆蛋白提取物與考馬斯亮藍G-250 染色劑結合，產生變色反應，考馬斯亮藍G-250 在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488 nm 處，當它與蛋白質結合后變為青色，蛋白質-色素結合物在595 nm 波長下有最大光吸收[19]。因此提取物中含有蛋白類化合物。

2.6.2 紅外光譜檢測

青豆蛋白紅外光譜檢測圖見圖6。

圖6 紅外光譜檢測結果分析圖Fig.6 Analysis diagram of infrared spectrum detection results

紅外光譜檢測結果如圖6 所示，樣品的紅外光譜于3 306.22 cm-1的位置呈現寬而強的吸收峰，3 306.22 cm-1在 3 700 cm-1～3 300 cm-1范圍內，是-OH 的伸縮峰，說明青豆提取物里面含有大量的酚羥基、醇羥基；于2 936 cm-1的位置呈現出弱的振動吸收峰，2 936 cm-1處于3 000 cm-1～2 700 cm-1之間，是C-H 鍵的伸縮振動峰，表明青豆提取物里面含有較少的飽和碳上的氫[20]；青豆提取物里面含有的官能團與蛋白質的標準品一致，因此可以確定提取物是蛋白質類化合物。

2.6.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

青豆蛋白凝膠電泳分析圖見圖7。

圖7 SDS-PAGE 電泳分析圖Fig.7 SDS-page analysis chart

由圖7 所示，青豆蛋白的SDS-PAGE 圖譜可以清晰看出，青豆蛋白多以大分子的結構存在，其分子質量主要集中在50 kD～85 kD 之間，50 kD 分子量以下蛋白質亞基幾乎不存在?？梢源_定為高分子蛋白質。

3 結論

本試驗利用超聲波輔助法提取青豆蛋白，以超聲時間，超聲功率，液料比為主要考慮因素，以青豆蛋白得率為響應值，通過Design-Expert 軟件對青豆蛋白的提取工藝進行優化，確定了最佳提取工藝條件為：料液比 1∶20（g/mL），超聲功率 470 W，超聲時間 27 min，得到青豆蛋白得率為（41.90±0.43）%，純度為73.56%，相較于傳統的堿溶酸沉法提取蛋白質得率提高了12.22%。

通過單因素試驗確定了豆渣膳食纖維的最佳提取工藝為：pH9.5，提取溫度50 ℃，提取時間40 min。

對粗提物進行了凱氏定氮試驗，考馬斯亮藍試驗，紅外光譜測定及SDS-PAGE 電泳分析，試驗結果證明，該粗提物中含有蛋白質，并確定所提物質為青豆粗蛋白質。