冬蟲夏草對氧化損傷小鼠抗氧化作用研究

羅勝勇，栗原博，樂智勇，于留榮，曹暉

（1.暨南大學藥學院，廣東廣州510632；2.安徽省醫學科學研究院，安徽合肥230061；3.康美藥業股份有限公司，廣東揭陽522000；4.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515；5.暨南大學嶺南中藥研究中心，廣東廣州510632）

生物體在新陳代謝過程中，會不斷產生各種活性氧自由基。正常生理情況下，適量的氧自由基對維持機體的健康具有重要作用[1]，但當自由基生成過多時，則會出現氧化損傷[2]，使得機體蛋白質、DNA 和脂類物質被破壞，正常細胞信號傳導被干擾，進而導致諸如心腦血管疾病、炎癥、抑郁癥、腫瘤、衰老等多種疾病的發生[3-7]。因此，開發安全、有效的具有抗氧化作用的產品越來越受到醫藥研究者的重視。冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）為麥角菌科真菌寄生在蟲草蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus）幼蟲上的子座及幼蟲內菌核的復合體，是一種名貴的滋補性傳統中藥材，具有免疫調節、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤、降血糖等多種藥理作用[8-9]。關于其抗氧化能力以往研究也較多，但主要都集中在其體外抗氧化能力方面，而對于冬蟲夏草體內抗氧化作用目前還缺少報道。因此，本實驗按照我國《保健食品檢驗與評價技術規范》（國食藥監?；痆2012]107 號附件3）中抗氧化功能評價方法，對冬蟲夏草體內抗氧能力進行全面深入研究，并初步探討其作用機制，以期能為今后更加科學合理的蟲草資源、開發抗氧化的產品提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

天然冬蟲夏草（批號201607）：康美（北京）藥物研究院有限公司；D-半乳糖（批號20160406）：國藥集團化學試劑有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號20170622）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（批號 20170626）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒（批號 20170627），蛋白質羰基測試盒（批號2-170908），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（批號 20170916）、總抗氧化能力（total antioxidant activity，T-AOC）測試盒（批號20170912）：南京建成生物工程研究院。RNAiso Reagent（批號 AA4608-1）、反轉錄試劑盒（批號AK5306）、Taq DNA 聚 合 酶 、Easy Dilution 稀 釋 液 ：TaKaRa公司；引物由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。

1.2 實驗動物

1.3 儀器與設備

AL104 電子天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；UV-1750 紫外可見分光光度計：日本島津公司；電熱水浴鍋：上海醫療器械五廠；GL-16G-Ⅱ型高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠氧化損傷模型建立（D-半乳糖誘導）

取健康成年雄性ICR 小鼠（SPF 級），適應性飼養后，選取體重25 g～30 g 的動物進行造模，造模動物頸背部皮下注射D-半乳糖120 mg/（kg·BW），空白組動物頸背部皮下注射等體積氯化鈉注射液，注射量均為0.1 mL/10 g，每日1 次，連續注射6 周，內眥靜脈取血測MDA，選取與空白組比較MDA 有明顯升高的動物，隨機分組[10]。

1.4.2 分組及給受試物

取造模成功動物隨機分為模型組、陽性組[維生素E，100 mg/（kg·BW）]、冬蟲夏草高[1 g/（kg·BW）]、中[0.5 g/（kg·BW）]、低[0.25 g/（kg·BW）]劑量組，每組10 只，分別灌胃給予相應受試樣品，灌胃體積為0.2 mL/（10 g·BW），另取10 只正常動物作為空白組?？瞻捉M和模型對照組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1次，連續30 d。在給受試樣品的同時，模型對照組和受試樣組頸背部皮下繼續注射120 mg/（kg·BW）D-半乳糖，正常組動物頸背部皮下注射等體積氯化鈉注射液，注射量均為0.1 mL/10 g。造模及給受試物期間，每周稱1 次體重，依據體重調整給受試物的體積。

1.4.3 血清中 MDA、蛋白羰基、GSH 含量，SOD、GSHPx、T-AOC 活性測定

給各受試樣品30 d 后，動物斷頭取血，3 000 r/min離心10 min 后，取血清，按試劑盒說明書測定血清中MDA、蛋白羰基、GSH 含量及 SOD、GSH-Px、T-AOC活性。

目前，依托南方電網大平臺優化配置資源的作用，南方電網云南電網公司還將不斷擴大西電東送規模，最大限度地消納云南清潔水電。到2030年，云南省清潔能源總裝機將達到1.3億千瓦，最大電力外送能力將超過5000萬千瓦，屆時，云南將成為全國最重要的綠色能源基地和西電東送能源基地之一，電力行業將成為云南打造綠色能源牌的主力軍和排頭兵，云南清潔水電資源優勢，也將進一步轉化成為產業優勢、經濟優勢和發展優勢。

1.4.4 肝臟及腦組織中MDA 含量，SOD、GSH-Px 活性測定

迅速取肝臟和腦組織，稱取部分肝組織和腦組織塊，加入生理鹽水，組織勻漿器制備成10%肝組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min 后，取上清液按試劑盒說明書測定肝臟及腦組織中MDA 含量，SOD、GSH-Px 活性。

1.4.5 實時定量聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測肝組織中SOD 和 GSHPx 基因表達量

隨機取5 只動物剩余肝臟組織用無菌磷酸鹽緩沖液清洗3 次后，加液氮研磨后，加入Trizol 后提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 的濃度及純度，利用逆轉錄試劑盒合成cDNA 后，取2 μL 進行RT-PCR[11-12]檢測，逆轉錄過程及RT-PCR 過程參照說明書進行。最終結果以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，采用與熒光定量PCR 儀配套Step One Software v2.1 分析PCR數據。引物信息見表1。

1.5 數據統計

2 結果與分析

2.1 冬蟲夏草對小鼠血清中MDA含量的影響

各組小鼠血清中MDA 含量見表2。

表2 各組小鼠血清中 MDA 含量（±s，n=10）Table 2 The MDA content in serum of each group mice（±s，n=10）

表2 各組小鼠血清中 MDA 含量（±s，n=10）Table 2 The MDA content in serum of each group mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，ΔΔp＜0.01 差異極顯著；與模型組比較，*p＜0.05差異顯著，**p＜0.01 差異極顯著。

組別劑量/（g/kg）MDA/（nmol/mL）造模后 給受試樣品后空白 3.31±0.86 3.25±0.82模型 7.40±1.49ΔΔ 7.61±1.56ΔΔ陽性 0.1 7.38±1.63ΔΔ 5.02±1.02**冬蟲夏草高劑量 1 7.48±1.32ΔΔ 5.31±1.69**冬蟲夏草中劑量 0.5 7.36±1.27ΔΔ 5.67±1.40**冬蟲夏草低劑量 0.25 7.29±1.53ΔΔ 6.37±1.22*

通過對表2 數據進行方差分析，造模后，與空白組比較，各組MDA 含量明顯升高，表明造模成功。給受試樣品30 d 后，與模型組比較，冬蟲夏草高、中、低劑量組MDA 含量均明顯降低，差異有顯著性（p＜0.01，p＜0.05）。表明冬蟲夏草高、中、低劑量可明顯降低血清中MDA 含量。

2.2 冬蟲夏草對動物血清中蛋白質羰基、GSH含量及GSH-Px、SOD、T-AOC活性的影響

各組小鼠血清中蛋白質羰基、GSH 含量及GSHPx、SOD、T-AOC 活性見表3。

表3 各組小鼠血清中蛋白質羰基、GSH 含量及 GSH-Px、SOD、T-AOC 活性（±s，n=10）Table 3 The protein carbonyl，GSH contents and the GSH-Px，SOD，T-AOC activities in serum of each group mice（±s，n=10）

表3 各組小鼠血清中蛋白質羰基、GSH 含量及 GSH-Px、SOD、T-AOC 活性（±s，n=10）Table 3 The protein carbonyl，GSH contents and the GSH-Px，SOD，T-AOC activities in serum of each group mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，ΔΔp＜0.01 差異極顯著；與模型組比較，*p＜0.05 差異顯著，**p＜0.01 差異極顯著。

組別劑量/（g/kg） 蛋白質羰基/（nmol/mg）GSH/（mg/L）GSH-Px/（U/mL）SOD/（U/mL）T-AOC/（U/mL）空白 2.83±0.36 8.14±2.33 117.56±23.15 231.11±26.96 24.67±6.47模型 4.16±0.44ΔΔ 3.90±1.13ΔΔ 56.46±15.91ΔΔ 182.65±9.96ΔΔ 4.67±2.04ΔΔ陽性 0.1 3.55±0.52** 6.83±1.32** 102.33±32.67** 223.52±20.83** 20.82±5.33**冬蟲夏草高劑量 1 3.61±0.59* 5.69±1.68** 88.97±27.72** 215.63±20.62** 16.89±5.25**冬蟲夏草中劑量 0.5 3.76±0.31* 5.37±1.84* 82.35±16.68** 214.10±18.91** 15.06±5.56**冬蟲夏草低劑量 0.25 3.82±0.37 4.68±1.05 73.36±20.78* 200.32±15.23* 12.32±3.87**

通過對表3 數據進行方差分析，與空白組比較，模型組動物血清中蛋白質羰基含量明顯升高，GSH 含量，GSH-Px、SOD、T-AOC 活性明顯降低；與模型組比較，冬蟲夏草高、中劑量組動物血清中蛋白質羰基含量明顯降低，GSH 含量明顯升高；高、中、低劑量動物血清中GSH-Px、SOD、T-AOC 活性明顯升高，差異有顯著性。表明冬蟲夏草高、中劑量可明顯降低血清中蛋白質羰基含量，升高GSH 含量；高、中、低劑量可明顯升高動物血清中GSH-Px、SOD、T-AOC 活性。

2.3 冬蟲夏草對動物肝臟中MDA含量，SOD、GSHPx活性的影響

各組動物肝臟組織中MDA 含量，GSH-Px、SOD活性見表4。

通過對表4 數據進行方差分析，與空白組比較，模型組動物肝臟中MDA 含量明顯升高，GSH-Px、SOD活性明顯降低；與模型組比較，冬蟲夏草高、中、低劑量組動物肝臟中MDA 含量明顯降低，GSH-Px、SOD 活性明顯升高，差異有顯著性。表明冬蟲夏草高、中、低劑量均可明顯降低動物肝臟MDA 含量，升高GSHPx、SOD 活性。

表4 各組動物肝臟組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD 活性（±s，n=10）Table 4 The MDA content and the GSH-Px，SOD activities in liver of each group mice（±s，n=10）

表4 各組動物肝臟組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD 活性（±s，n=10）Table 4 The MDA content and the GSH-Px，SOD activities in liver of each group mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，ΔΔp＜0.01 差異極顯著；與模型組比較，*p＜0.05 差異顯著，**p＜0.01 差異極顯著。

組別劑量/（g/kg）MDA/（nmol/mL）GSH-Px/（U/mL）SOD/（U/mL）空白 7.33±1.38 156.36±33.35 258.33±46.72模型 13.46±2.42ΔΔ 86.73±20.09ΔΔ 200.61±18.37ΔΔ陽性 0.1 8.62±2.37** 142.53±33.37** 243.56±33.81**冬蟲夏草高劑量 1 9.02±2.76** 136.74±30.58** 240.65±30.65**冬蟲夏草中劑量 0.5 9.88±2.57** 122.63±26.48** 238.10±28.91**冬蟲夏草低劑量 0.25 10.76±2.89* 109.56±25.46* 220.43±22.23*

2.4 冬蟲夏草對動物腦組織中MDA含量，SOD、GSH-Px活性的影響

各組動物腦組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD 活性見表5。

表5 各組動物腦組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD活性（±s，n=10）Table 5 The MDA content and the GSH-Px，SOD activities in brain of each group mice（±s，n=10）

表5 各組動物腦組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD活性（±s，n=10）Table 5 The MDA content and the GSH-Px，SOD activities in brain of each group mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，ΔΔp＜0.01 差異極顯著；與模型組比較，*p＜0.05 差異顯著，**p＜0.01 差異極顯著。

組別劑量/（g/kg）MDA/（nmol/mL）GSH-Px/（U/mL）SOD/（U/mL）空白 6.79±1.12 102.43±20.65 213.25±27.82模型 12.04±2.38ΔΔ 50.32±16.21ΔΔ 168.65±12.37ΔΔ陽性 0.1 8.60±2.26** 80.54±22.73** 206.58±21.46**冬蟲夏草高劑量 1 9.12±2.55** 70.38±20.82* 188.72±22.64*冬蟲夏草中劑量 0.5 9.17±2.16** 67.26±20.61* 182.16±22.31*冬蟲夏草低劑量 0.25 9.52±2.65* 58.36±12.21 176.33±18.72

通過對表5 數據進行方差分析，與空白組比較，模型組動物腦組織中MDA 含量明顯升高，GSH-Px、SOD活性明顯降低；與模型組比較，冬蟲夏草高、中、低劑量組動物腦組織中MDA 含量明顯降低，高、中劑量組動物腦組織中GSH-Px、SOD 活性明顯升高，差異有顯著性。表明冬蟲夏草高、中、低劑量可明顯降低動物腦組織中MDA 含量，高、中劑量可明顯升高GSH-Px、SOD活性。

2.5 冬蟲夏草對動物肝臟組織中SOD、GSH-Px mRNA表達的影響

各組動物肝臟組織中SOD、GSH-Px mRNA 表達水平見圖1、圖2。通過對圖1、圖2 數據進行方差分析，與空白組比較，模型組動物肝組織中SOD、GSH-Px mRNA 表達水平明顯降低；與模型組比較，冬蟲夏草高、中劑量組動物肝組織中SOD、GSH-Px mRNA 表達水平明顯升高，差異有顯著性。表明冬蟲夏草高、中劑量可明顯升高動物肝組織中SOD、GSH-Px mRNA 表達水平。

圖1 各組小鼠肝臟組織中SOD mRNA 表達Fig.1 The SOD mRNA expression in liver of each group mice

圖2 各組小鼠肝臟組織中GSH-Px mRNA 表達Fig.2 The GSH-Px mRNA expression in liver of each group mice

3 結論與討論

D-半乳糖氧化損傷模型，是研究抗氧化藥物的經典模型[13]，并作為研究抗氧化功能保健食品指定的造模方法。連續大劑量皮下注射D-半乳糖后，在小鼠機體細胞內由醛糖還原酶催化，還原生成半乳糖醇，半乳糖醇不能被細胞進一步代謝，在細胞內大量堆積，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹和功能障礙[14-15]，最終會引起機體代謝紊亂、抗氧化物質活性下降、自由基堆積，從而產生氧化損傷效應。本實驗通過皮下注射D-半乳糖構建小鼠氧化損傷模型，研究冬蟲夏草的體內抗氧化活性。與空白組相比，模型組小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA 含量明顯升高，GSH 含量明顯降低，SOD、GSH-Px、T-AOC 活力明顯下降。表明氧化損傷小鼠模型構建成功。

MDA 是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，其含量可反映機體內脂質過氧化程度，蛋白羰基是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標志，可直接反映蛋白質的損傷程度[16]；GSH 是一種低分子清除劑，可清除O2-自由基、H2O2、LOOH，其含量多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。SOD 主要催化O2-自由基生成H2O2，再由其他抗氧化酶如GSH-Px 和過氧化氫酶作用生成水，其酶活性高低反應機體清除自由基能力[17]；GSH-Px 是體內存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應的系統，對防止體內自由基引起膜脂質過氧化至關重要，SOD 和GSH-Px 兩者之間明顯存在著相互保護作用和協同抗氧化作用[18]?？偪寡趸芰Γ═-AOC）代表機體抗氧化酶系統和非酶系統對外來刺激的代償能力以及機體自由基的代謝狀態，是反應機體抗氧化能力的良好指標，可從整體上反映機體的抗氧化能力[19]。因此，通過檢測體內MDA、蛋白質羰基、GSH 含量以及 SOD、GSH-Px、T-AOC 活性可全面了解體內自由基的產生和清除情況。本研究結果顯示，與模型組比較，冬蟲夏草能明顯降低動物血清中MDA 蛋白質羰基含量，升高GSH 含量，明顯升高動物血清中GSH-Px、SOD、T-AOC 活性，對于肝臟和腦組織，冬蟲夏草也均能明顯降低其中的MDA 含量，升高GSH-Px、SOD 活性，表明冬蟲夏草具有明顯的體內抗氧化能力。進一步研究發現，冬蟲夏草能明顯促進小鼠肝臟中SOD、GSH-Px mRNA 的表達水平，這與對應的抗氧化酶活力增強結果相一致。

綜上所述，冬蟲夏草對氧化損傷小鼠體內抗氧化能力有明顯增強作用，其機制可能與攝入冬蟲夏草后，體內的相關抗氧化酶基因mRNA 表達上調，使得SOD、GSH-Px 抗氧化酶活力增強，機體獲得較高清除自由基的能力，從而降低體內脂質和蛋白質過氧化損傷有關。