不同生長期懷山藥化學成分分析

馬蕊，楊珂，李文輝，劉玲玲，陳隨清

（河南中醫藥大學藥學院，河南鄭州450046）

山藥為藥食同源之品，為薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb.）的根莖[1]。味甘性平，具有補脾養胃、生津益肺、補腎澀精的功效。主要含有淀粉、蛋白質等營養成分及多糖、尿囊素、腺苷、甾醇類[2-4]等多種活性成分，具有調節免疫、抗氧化抗衰老、降糖和調整消化系統等藥理作用[5-8]。山藥是具有補益作用的上等藥材，同時又是具有很高營養價值的食材，憑借著其藥食兼用，且平補三焦的特點已經成為全國各地餐桌上的必備美食[9]。

山藥主產于河南、山西、河北等地，明、清以來認為“懷慶”者佳，即河南省焦作地區，這也是現代認為的山藥道地產區，并將這里產的山藥稱為“懷山藥”，此“懷山藥”指現代所說的中藥材。懷山藥主要栽培品種為懷山藥[指植物薯蕷的栽培品種，為了和中藥材“懷山藥”名稱區別，以下統稱為懷山藥（品種）]和鐵棍山藥，所以本試驗研究材料確定為懷山藥（品種）和鐵棍山藥。

自古藥材就有“按時而收”的要求，采收時間直接影響山藥的營養價值與藥用價值，中藥適宜采收期確定的一般原則需要把有效成分的動態積累與藥用部分的產量變化等因素結合起來考慮[10]。據文獻及產地調查，懷山藥采收時間為霜降后地上莖葉枯萎后采收，但是未有確切的數據表明山藥化學成分的變化規律，并且有部分商家為了提前出售，會在采收期前進行采挖，影響山藥質量。所以本試驗采收各個時期的懷山藥（品種）和鐵棍山藥，測定其水溶性浸出物、山藥多糖、尿囊素、腺苷、單糖和寡糖等，將懷山藥化學成分的積累規律，與藥用部位折干率結合，確定最佳采收期，研究其適宜采收期有助于提高山藥質量，保證其營養價值，同時為山藥規范化種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

依據懷山藥生長規律，將采樣時間定為9月～12月，采樣地點為焦作溫縣、武陟等地，每間隔15 d 左右采樣一次。

懷山藥（品種）由于含水量大，冬天若沒有加工完，在低溫環境中易凍壞，農戶一般在來年開春進行采收，所以懷山藥（品種）采收時期分別為：9月15日、9月28日、10月16日、11月4日、11月16日、12月1日、12月18日、1月3日、1月16日、2月10日、2月27日。平行采樣3 批。

鐵棍山藥采收時期分別為：9月19日、10月2日、10月18日、11月1日、11月15日、12月5日、12月18日。平行采樣4 批。

試驗所用藥材由河南中醫藥大學藥學院陳隨清教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb.）的根莖。

1.2 儀器

UV-2600 紫外分光光度計、LC-20A 高效液相色譜儀：日本島津公司；ME203E 十萬分之一分析天平：梅特勒·托利多儀器（上海）有限公司；BSA124S-CW萬分之一天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Milli-Q Academic A10 超純水機：美國Millipore 公司。

1.3 試藥

尿囊素（批號B20909，質量分數≥98%）、腺苷（批號B21356，質量分數≥98%）、果糖（批號 B21896，質量分數≥99 %）、麥芽糖（批號 B20834，質量分數≥98 %）、蔗糖（批號111507-200302，質量分數≥99%）：上海源葉生物有限公司；葡萄糖（批號110833-200503，質量分數≥98 %）、麥芽三糖（批號100274-200601，含量為100%）：中國食品藥品檢定研究所；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 折干率計算

根據實驗室前期試驗基礎，將鮮山藥采挖出來之后除去蘆頭稱重，清洗干凈，去皮，切5 mm 厚片，采用熱風干燥的方法進行加工，溫度開始用80 ℃烘，每隔3h降10℃至50℃，之后每隔1h降10℃至30℃，待山藥片完全烘干拿出降至室溫后稱重計量。

計算公式：折干率/%=干重/鮮重×100

1.4.2 浸出物含量測定

按照2015 版《中國藥典》四部（通則2201）項下的冷浸法測定。

1.4.3 山藥多糖含量測定

在實驗室前期研究基礎上[11]，采用紫外分光光度法測定山藥多糖的含量。

1.4.4 尿囊素含量測定

1.4.4.1 色譜條件

色譜柱：Xqua C18（250 mm×2.5 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（2∶98）；柱溫：30 ℃；流速：0.5 mL/min；檢測波長：224 nm；進樣體積：10 μL，理論塔板數按尿囊素峰計算不低于5 000。樣品和對照品的色譜圖見圖1。

1.4.4.2 對照品溶液的制備

精密稱取尿囊素對照品2.08 mg，至5mL容量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.416 g/L 的對照品溶液。

圖1 山藥尿囊素色譜圖Fig.1 Allantoin chromatogram of yam

1.4.4.3 供試品溶液制備方法

取山藥樣品磨成細粉，過三號篩，取粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（40 kHz，100 W）30 min，放冷，加 50%甲醇補足減失重量，濾過，取續濾液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

1.4.4.4 方法學考察

線性關系：精密吸取上述對照品溶液 1、2、5、10、15、20 μL，按 1.4.4.1 色譜條件進樣，以峰面積值（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，得回歸方程：Y尿囊素=627 915X+26 879（R2=0.998），線性范圍為 0.41 μg～8.32 μg，線性關系良好。

精密度：精密吸取上述對照品溶液10 μL，連續進樣6 次，測定尿囊素峰面積RSD 為0.84%，表明儀器精密度良好。

重復性：精密稱取同一批山藥樣品粉末6 份，按1.4.4.3 制備供試品溶液，精密吸取 10 μL 按 1.4.4.1 色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按干燥品計算，結果尿囊素平均含量RSD 為2.41%，表明本研究方法重復性良好。

穩定性：吸取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣，測定峰面積，并計算峰面積 RSD值為1.56%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

回收率：取9 份已知含量的山藥樣品粉末0.5 g，精密稱定，加入濃度為1.34 g/L 尿囊素對照品溶液，制備低、中、高不同濃度的供試品溶液，每一濃度3 份，按1.4.4.3 制備供試品溶液操作，取 10 μL 按 1.4.4.1 色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算尿囊素平均回收率為98.85%，RSD 為2.92%，結果見表1。

表1 尿囊素回收率試驗結果（n=9）Table 1 Results of allantoin recovery test（n=9）

1.4.4.5 樣品測定

取不同生長期懷山藥樣品，按1.4.4.3 供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按1.4.4.1 色譜條件進行測定尿囊素的峰面積以回歸方程計算含量。

1.4.5 腺苷含量測定

1.4.5.1 色譜條件

色譜柱為Xqua C18（250 mm×2.5 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶水（13∶87）；檢測波長為 260 nm；柱溫30 ℃；流速 1.0 mL/min；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，樣品中腺苷與其他組分獲得了較好的分離，對照品和樣品的色譜圖見圖2。

1.4.5.2 對照品溶液的制備

精密稱定腺苷對照品1.95 mg，至50mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，得對照品儲備液。精密移取此溶液2mL至5mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，即得對照品溶液。

圖2 山藥腺苷色譜圖Fig.2 Adenosine chromatogram of yam

1.4.5.3 供試品溶液制備方法

取山藥樣品磨成細粉，過三號篩，取粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（40 kHz，100 W）30 min，放冷，加 50%甲醇補足減失重量，濾過，取續濾液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

1.4.5.4 方法學考察

線性關系：精密吸取上述對照品溶液1、2、5、10、15、20、25、30 μL 按 1.4.5.1 色譜條件進樣，以峰面積值（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，得回歸方程：Y腺苷=3 323 373X-5 296.11（R2=1），線性范圍為 0.015 μg～0.468 μg，線性關系良好。

精密度：精密吸取上述對照品溶液20 μL，連續進樣6 次，測定腺苷峰面積RSD 為0.1%，表明儀器精密度良好。

重復性：精密稱取同一山藥樣品粉末6 份，按1.4.5.3 項下制備供試品溶液，精密吸取20 μL 按1.4.5.1 色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按干燥品計算，結果腺苷平均含量RSD 為1.89%，表明本研究方法重復性良好。

穩定性：吸取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣，測定峰面積，并計算峰面積 RSD值為0.80%，結果腺苷在24 h 內穩定性良好。

回收率：取9 份已知含量的山藥片樣品粉末0.5 g，精密稱定，加入濃度為0.16 g/L 尿囊素對照品溶液，制備低、中、高不同濃度的供試品溶液，每一濃度3 份，按1.4.5.3 制備供試品溶液操作，取 10 μL 按 1.4.5.1 色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算腺苷平均回收率為96.27%，RSD 為2.17%，結果見表2，表明本研究方法回收率較好。

表2 腺苷回收率試驗結果（n=9）Table 2 Results of allantoin recovery test（n=9）

1.4.5.5 樣品測定

取不同生長期懷山藥樣品，按1.4.5.3 供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按1.4.5.1 色譜條件進行測定腺苷的峰面積以回歸方程計算含量。

1.4.6 單糖、寡糖含量測定

1.4.6.1 對照品溶液的制備

精密稱定果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖對照品 10.05、21.21、10.00、12.09、12.35 mg 至 2mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得濃度分別為5.025、10.605、5.00、6.045、6.175 g/L 的對照品溶液。

1.4.6.2 供試品溶液的制備

將山藥樣品磨成細粉，過三號篩，取粉末1 g，置具塞錐形瓶中，加15mL水煮沸15 min，冷卻至60 ℃以下，加入5mL新鮮配制的2 %淀粉酶溶液55 ℃保溫1 h，并時時振搖，然后加一滴碘試液，應不顯藍色，若顯藍色，再加熱糊化，并加5mL淀粉酶溶液繼續保溫，直至碘不顯藍色為止。加熱至沸，冷后移入50mL容量瓶中，并加水至刻度，混勻，過濾。取續濾液用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.4.6.3 色譜條件

色譜柱Inertsil NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）；檢測器為示差檢測器；流動相：乙腈-水（80∶20）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL?；旌蠈φ掌芳吧剿帢悠飞V圖見圖3。

圖3 山藥單糖、寡糖色譜圖Fig.3 Monosaccharide and oligosaccharide chromatogram of yam

1.4.6.4 方法學考察

線性關系：將果糖、葡萄糖、蔗糖標準溶液稀釋，得到果糖不同濃度標準溶液：0.040、0.201、0.500、1.005、2.513、5.025 g/L，葡萄糖不同濃度標準溶液：0.133、0.265、0.530、1.061、2.121、10.605 g/L，蔗糖不同濃度標準溶液：0.125、0.250、0.500、1.000、5.000 g/L，精密吸取上述標準溶液20 μL，按1.4.6.3 色譜條件進樣，精密吸取上述麥芽糖和麥芽三糖對照品溶液 2、5、10、20、30、40 μL，按 1.4.6.3 色譜條件進樣，以峰面積值（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，分別得五個回歸方程：Y果糖=7 984.4X-10 793（R2=0.998） 線性范圍為 0.804 μg～100.5 μg；Y葡萄糖=7 232.8X-4 666.5（R2=1），線性范圍為2.651 μg ～212.1 μg；Y蔗糖=9 215X-7 893.3（R2=0.998），線性范圍為 2.5 μg～100 μg；Y麥芽糖=5 200.6X-9 217.6（R2=0.998），線性范圍為 12.09 μg ～241.8 μg；Y麥芽三糖=2 913.7X-15 753（R2=0.998），線性范圍為 12.35 μg～247 μg，線性關系均良好。

精密度：精密吸取上述對照品溶液20 μL，連續進樣6 次，測定果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三塘峰面積 RSD 為 0.79 %、0.73 %、0.85 %、0.51 %、0.49 %，表明儀器精密度良好。

重復性：分別精密稱取同一山藥樣品粉末6 份，按1.4.6.2 制備供試品溶液，精密吸取 20 μL 按 1.4.6.3 色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按干燥品計算，結果果糖平均含量RSD 為1.62%，葡萄糖平均含量RSD 為1.95%，蔗糖平均含量RSD 為2.10%，麥芽糖平均含量RSD 為2.34%，麥芽三糖平均含量RSD 為2.27%，表明本研究方法重復性良好。

穩定性：吸取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣，測定峰面積，測得果糖峰面積RSD 值為1.13%，葡萄糖峰面積RSD 值為1.20%，蔗糖峰面積RSD 值為1.51%，麥芽糖峰面積RSD 值為1.11%，麥芽三糖峰面積RSD 值為1.14%，結果表明果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三塘在24 h 內穩定性良好。

回收率：取9 份已知含量的山藥樣品粉末0.5 g，精密稱定，加入不同量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖對照品，制備低、中、高不同濃度的供試品溶液，每一濃度 3 份，按 1.4.6.2 方法操作，取 20 μL 按按1.4.6.3 色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖的平均回收率分別為98.79%、101.37%、98.01%、98.52%、100.58%，RSD 分別為2.29%、2.37%、2.87%、2.89%、2.98%，結果表明本研究方法回收率較好。

1.4.6.5 樣品測定

取不同生長期懷山藥樣品，按1.4.6.2 方法操作，取20 μL 按1.4.6.3 色譜條件進行測定，測定果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖的峰面積以回歸方程計算樣品含量。

2 結果與分析

2.1 折干率

在懷山藥不同生長期中，懷山藥（品種）從開始采集日期9月15日開始，折干率呈逐漸上升趨勢，到12月初趨于最大值，之后的4 次采集呈平穩狀態，略有下降，但是次年2月27日最后一次采集的折干率下降了2%，如圖4。

圖4 懷山藥（品種）折干率折線圖Fig.4 Line chart of Huai yam drying rate

表明懷山藥（品種）9月至12月逐漸生長，養分逐漸增多，折干率增大，12月之后地上莖葉枯萎時，折干率趨于平穩，山藥處于休眠狀態，到次年2月27日，懷山藥（品種）由于在地下保存時間過長，水分養分逐漸消耗，另一方面懷山藥（品種）此時根莖開始萌發，會進一步消耗養料，所以折干率大幅下降[12]。

鐵棍山藥從開始采集日期9月19日開始，折干率呈逐漸上升趨勢，到11月中旬達最大值，之后折干率呈相對平穩狀態，如圖5。

圖5 鐵棍山藥折干率折線圖Fig.5 Line chart of Tiegun yam drying rate

表明鐵棍山藥9月至11月中旬逐漸生長，養分逐漸增多，折干率增大，隨后折干率趨于平穩。

2.2 不同生長期化學成分分析

對不同生長期懷山藥化學成分進行分析，懷山藥（品種）水溶性浸出物含量、腺苷含量在12月18日之前的6 次取樣呈逐漸上升趨勢，水溶性浸出物含量變化范圍為（17.52±3.73）%～（19.26±0.69）%、腺苷含量變化范圍為（0.027±0.001）%～（0.032±0.007）%，中間1次～2 次出現折點，含量有所降低，但是整體趨勢上升，12月18日之后這些含量達到穩定狀態；尿囊素含量從9月開始波動變化，到12月18日含量有所降低，從（0.97±0.20）%降至（0.85±0.11）%，隨后平緩上升；山藥多糖含量從9月中旬開始逐漸下降，到11月初達最低值（6.14±0.38）%，隨后逐漸上升，到 12月18日達最大（13.90±2.33）%，之后達到穩定狀態；果糖含量逐漸上升，波動不大，到 1月中旬達最大值（1.59±0.35）%，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖變化趨勢一致，開始逐漸升高，但是葡萄糖和麥芽糖在12月初達最大值，蔗糖在12月中旬達最大值，葡萄糖和麥芽糖最大值分別是（26.78±2.25）%，（42.10±1.21）%，蔗糖最大值是（1.78±0.13）%，隨后三者均平緩下降，麥芽三糖與其他單糖寡糖變化相反，開始含量逐漸降低，到12月中旬達最小值，隨后逐漸上升，如圖6。

圖6 不同生長期懷山藥（品種）化學成分積累圖Fig.6 Accumulation of chemical constituents of Huai yam in different growth period

鐵棍山藥各化學成分變化規律與懷山藥（品種）相近，水溶性浸出物含量、腺苷含量逐漸上升，水溶性浸出物含量變化范圍為（14.20±0.58）%～（15.48±1.86）%、腺苷含量變化范圍為（0.024±0.002）%～（0.032±0.001）%，中間1 次～2 次出現折點，含量有所降低，但是整體趨勢上升；尿囊素含量從9月開始波動變化，到12月18日含量有所降低，從（1.22±0.17）%降至（0.96±0.03）%；山藥多糖含量從采樣開始逐漸下降，到11月初達最低值（5.43±1.00）%，隨后逐漸上升；果糖含量逐漸上升，波動不大，到12月中旬達最大值（1.06±0.08）%，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖變化趨勢一致，開始逐漸升高，在12月中旬達最大值，葡萄糖最大值為（30.74±1.63）%，蔗糖最大值是（1.70±0.94）%，麥芽糖最大值是（40.88±1.17）%，麥芽三糖與其他單糖寡糖變化相反，含量逐漸降低，到12月中旬達最小值，如圖7。

圖7 不同生長期鐵棍山藥化學成分積累圖Fig.7 Accumulation of chemical constituents of Tiegun yam in different growth period

3 結論與討論

由懷山藥（品種）和鐵棍山藥折干率動態積累圖可以得出，山藥在12月以前是生長旺盛期，進行營養物質的不斷積累，折干率也逐漸增大，12月以后折干率趨于平穩，表明折干率已達到最大值，懷山藥（品種）和鐵棍山藥進入休眠期。根據產地調查情況，懷山藥（品種）采挖出來之后進行產地加工，但是全部采挖出來加工不完，冬天氣溫過低，山藥含水量大過冬易凍壞，造成損失，所以農戶多在次年2月進行采挖，根據折干率變化趨勢，到次年2月底，折干率有所下降，建議農戶采挖時在2月底采挖完全，若3月采挖折干率會有所下降。鐵棍山藥在11月中旬就已達到折干率最大值，可根據化學成分積累規律進行采挖售賣。

縱觀懷山藥化學成分變化規律，水溶性浸出物反應了懷山藥中可溶性物質的多少，較整體反應懷山藥的質量[13]，懷山藥（品種）和鐵棍山藥浸出物含量均逐漸上升，到12月中旬達最大值；山藥多糖是山藥主要活性成分[14]，兩種懷山藥在積累先下降再上升，至12月中旬達最大值；尿囊素和腺苷是懷山藥中有效化學成分[15]，是植物次生代謝產物，變化較為平穩，其中尿囊素含量有所下降，腺苷呈上升趨勢；懷山藥中淀粉是最重要的營養物質，本試驗將其水解為單糖、寡糖，進一步觀察其變化規律，懷山藥（品種）果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖在整個生長過程中含量變化較大，整體來說在果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖在12月中旬之前呈上升趨勢，之后有所下降，但是果糖、葡萄糖最終含量是增高了，而蔗糖和麥芽糖含量降低，推斷在懷山藥（品種）在休眠期時維持自身生長消耗了體內的糖類成分，而低聚糖蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖降解成了果糖、葡萄糖，所以果糖、葡萄糖最終含量是上升的，麥芽三糖與其他單糖寡糖變化相反，開始呈下降趨勢，到12月中旬之后有所上升，鐵棍山藥在12月中旬之前與懷山藥（品種）變化一致。懷山藥化學成分含量趨勢都會有折點出現，推斷是養分在積累過程中自我消耗導致降低，隨后植物體又合成使含量升高，也可能是天氣驟變導致化學物質合成受到影響。

綜上所述，將懷山藥的產量與化學成分積累規律綜合考慮得出：懷山藥（品種）在12月中旬折干率和化學成分都達到最大，適合采收，但是經產地調查發現，農戶會等到第二年2月左右大規模采收，原因是懷山藥（品種）采收出來后進行產地加工，由于懷山藥（品種）產量大，并且產地加工歷程時間長，如果第一年12月將其全部采收出來后，農戶會加工不完，山藥含水量大過冬易凍壞，造成藥材損失，所以農戶多在過冬后采收，但是結合折干率和化學成分積累規律，建議在次年3月前采收完畢，以免產量和有效成分含量降低；鐵棍山藥在11月中旬折干率就達到最大值，但是有效成分含量到12月中旬達到最大值，所以結合折干率及有效成分含量，12月中旬采挖最好。數據結論與山藥傳統采收時間一致，表明傳統采收時間科學合理，本研究為懷山藥的科學食用、合理采收、規范化種植提供了理論依據。