多指標評價酶解蠶蛹蛋白產物的抗氧化活性

牛明福，陳金帥，李桃月，李俊毅，李陽

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471003）

蠶蛹，作為我國桑蠶產業中大宗的副產物，資源十分豐富，它富含蛋白質[1]，包含18 種氨基酸，必需氨基酸的含量占40%[2]，氨基酸占比合理均衡，具有較高的營養價值[3]，是衛生部認可的優質的氨基酸來源[4]，但是對于干蠶蛹的利用，大多處于初加工階段，真正的價值并未被開發利用，亟待進行深加工處理[5]。

蠶蛹蛋白酶解可以產生大量的多肽及寡肽[6]，這些多肽及寡肽具有較強的生理活性，其生理活性主要由酶解產物中的多肽氨基酸殘基的組成決定[7]，這些生物活性肽有著較強的生理功能，具有提高機體免疫能力、促進脂肪代謝、降低高膽固醇、延緩衰老和清除自由基等功能[8-11]。閔建華等[12]探討多種酶對蠶蛹蛋白的酶解，得出蛋白酶對蠶蛹蛋白有較好的酶解效果，且有較好的抗氧化作用。張明春等[13]以胰蛋白酶酶解蠶蛹蛋白，超濾制備生物活性肽，能夠促進糖代謝中丙酮酸的生成。楊安樹等[14]利用木瓜蛋白酶與風味蛋白酶，復合酶解蠶蛹蛋白，其多肽得率為32%。

目前蠶蛹蛋白酶解制備多肽或氨基酸的技術主要有：堿水解、酸水解，堿水解其腥味和褐變難以克服，且會造成消旋作用，影響其生理活性[15]；酸水解對水源造成污染，對設備造成腐蝕，且會使部分氨基酸破壞甚至完全破壞[16]；而采用酶解的方法，克服了酸堿水解的缺點，相對環保、經濟、有效等[17-18]，因此文章選用酶解的方法，以DPPH·清除率、O2-·清除率、總還原能力和金屬離子螯合力等常用體外抗氧化模型為指標，來研究酶解蠶蛹蛋白產物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蠶蛹：由伊川縣桑農提供。中性、酸性、木瓜、獼猴桃、風味、復合、堿性、菠蘿蛋白酶：合肥博美生物有限公司；DPPH：上海藍季科技發展有限公司，1.10-菲啰啉：科密歐化學試劑有限公司，鄰苯三酚：上海伊卡生物技術有限公司，無水乙醇：天津市風船化學試劑科技有限公司，石油醚：鄭州海賽化工產品有限公司，鹽酸：河南聚興化工有限責任公司，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、三氯化鐵：蘇州市峰益化工有限公司，鐵氰化鉀：重慶昆侖化工有限公司，三氯乙酸、H2O2：奧德利化工產品銷售有限公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris base）：上?；鄯f生物科技有限公司。

1.2 儀器和設備

N4 型紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；DJ-8D 型電熱恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；101 型電熱鼓風干燥箱：北京市永光明醫療有限公司；K9860 型全自動凱氏定氮儀：海能儀器有限公司；DSA50 超聲波清洗機：福州德森精工有限公司；JB-2恒溫磁力攪拌器：上海雷磁創益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解產物的制備

1.3.1.1 脫脂蠶蛹粉的制備與酶解

取一定量蠶蛹，在電熱鼓風干燥箱中60 ℃干燥24 h，至水分含量低于5%，粉碎過40 目篩，用索氏抽取法（溶劑石油醚）抽提三次脫去油脂，烘干直至恒重，置于干燥瓶內備用。

對蠶蛹蛋白酶解：分別取適量脫脂蠶蛹粉于試管中，加入一定pH 值的緩沖液，料液比為50 g/L，加酶量5 %，在最適溫度下酶解3 h，后調節pH 值為7.0，6 000 r/min 離心后取上清液，酶解條件如表1 所示。

1.3.1.2 多肽得率的測定

凱氏定氮法測出樣品中蛋白質含量m0，以及酶解液氮含量m1，茚三酮比色法測定游離氨基酸的質量m2，多肽得率如式 1 所示。

表1 8 種蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic conditions of 8 kinds of proteases

式中：D 為多肽得率；m1為酶解液中氮含量，g；m2為水解液中游離氨基酸含量，g；m0為樣品中蛋白質含量，g。

1.3.2 抗氧化性研究

1.3.2.1 DPPH·清除能力的測定

DPPH·溶于有機溶劑能形成一種穩定的自由基，在517 nm 處[19]有強吸收，通過加入自由基清除劑，紫外吸收減弱，可以通過紫外分光光度計來測量其減弱程度，從而評價抗氧化劑的清除能力[20]。

測定方法依據代衍峰等[21]略作修改，取1.0mL樣品液，加 2.0mLDPPH 溶液（0.1 mmol/L），振蕩均勻，室溫避光反應30 min，6 000 r/min 離心取上清，于517 nm處測吸光度A1，取1.0mL樣品液，加入2.0mL無水乙醇測其吸光度A2，以1.0mL去離子水代替樣品作空白對照測量其吸光度A0，按公式（2）計算。

式中：C1為 DPPH·清除率；A1為樣液加 DPPH 所測的吸光度；A2為樣液加無水乙醇的吸光度；A0為去離子水加DPPH 的吸光度。

1.3.2.2 O2-·清除能力的測定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化生成有色中間產物及O2-·，在紫外325 nm 處其吸光度隨之而增加，加入抗氧化劑，O2-·被清除，使有色產物的生成被阻礙，導致吸光度的下降，通過紫外分光光度計測吸光度的大小，來評價樣品對O2-·的清除能力。

測定方法依據王戈莎等[22]，取0.1 mol/L，pH 8.2 Tris-HCl 緩沖液 2.80 mL（其中含有 2 mmol/L EDTA），加0.10mL樣液混勻，于25 ℃水浴中保溫10 min，后加入25 ℃水浴預溫的3 mmol/L 的鄰苯三酚0.10 mL，混勻后迅速于干燥的石英比色皿中，在325 nm 下每隔0.5 min 測定一次OD 值，反應4.5 min 結束。以0.1mol/L，pH 8.2 Tris-HCl 緩沖液為空白調零，對照組以等體積去離子水代替樣品，作吸光度隨時間變化曲線的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率V，按下式計算樣品對O2-·的清除率。

式中：C2為 O2-·清除率；V1為對照組鄰苯三酚自氧化速率△OD/min；V2為樣品組鄰苯三酚自氧化速率△OD/min。

1.3.2.3 總還原能力的測定

鐵氰化鉀中的Fe3+被抗氧化劑還原成Fe2+，生成的產物在700 nm 處有最大吸收[23]，通過紫外分光光度計測其在700 nm 處的吸光度，可以評價樣品還原能力的大小，樣品的還原力與抗氧化能力正相關。

將2.0mL樣品溶液與5.0mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 值為 6.6）混勻，加入 5.0mL質量分數為1%鐵氰化鉀溶液，將混合物在50 ℃下保溫20 min，最后加入5.0mL體積分數為10 %的三氯乙酸（Trichloroacetic acid）溶液，混勻在 3 000 r/min 下離心10 min。取2.0mL上清液和1.0mL蒸餾水混合，加入0.5mL質量分數為0.1%氯化鐵溶液，于700 nm 下測量吸光度，吸光度越高說明樣品的還原能力越強。

1.3.2.4 金屬離子螯合力的測定

過渡金屬鐵、銅等可以引起脂肪過氧化反應，導致生物膜受到損害，產生了有毒的過氧化物[24]，通過樣品對金屬離子螯合的能力來體現其抗氧化機制。

取 800 μL 樣品液（20 mg/mL）置于試管中，加入10 μL 氯化亞鐵溶液（2 mmol/L）和 20 μL 菲啰啉溶液（5 mmol/L），混勻后于室溫反應 10 min，于 562 nm 下測其吸光度。

2 結果與分析

2.1 酶解產物的制備

2.1.1 蠶蛹粉的脫脂

脫脂后濾渣烘干，除去殘存溶劑，研磨后過篩，獲得精制脫脂蠶蛹粉，蛋白質含量64.32%。對脂質提取液減壓蒸餾，低溫脫溶分離得到油脂和溶劑，得出蠶蛹的油脂含量為29.63%。

2.1.2 多肽得率的分析

酶解蠶蛹蛋白的多肽得率結果如圖1 所示。

圖1 酶解蠶蛹蛋白的多肽得率Fig.1 Peptide yield of enzymatic hydrolyzed silkworm protein

8 種酶解蠶蛹蛋白多肽得率有較大差異，堿性蛋白酶酶解的多肽得率最高13.99%。酸性蛋白酶酶解的最低為7.37%?？赡艿脑蚴遣煌鞍酌该附庑示哂休^大差異，酶切位點也不太一致，因此酶解得到的蠶蛹蛋白多肽的分子質量大小不同，導致多肽得率有所不同。堿性蛋白酶的酶解效率最高，但其產物的抗氧化性能還需要進一步試驗。

2.2 抗氧化性能研究

2.2.1 DPPH·清除性能研究

若蛋白酶解產物能清除DPPH 所形成的自由基，則能表現出清除能力，試驗通過DPPH·清除率的高低來研究酶解產物的抗氧化性能。不同酶解產物DPPH·清除能力的測定結果如圖2 所示。

圖2 蠶蛹蛋白酶解多肽對DPPH·清除率Fig.2 DPPH·scavenging rate of silkworm proteolytic polypeptide

由圖2 可知，獼猴桃蛋白酶酶解產物的清除率最高為42.34%，堿性蛋白酶清除率次之為38.91%，酸性蛋白酶清除率最低為22.32%。結合多肽得率的測定結果，可能的原因是蛋白酶具有專一性，因此不同蛋白酶對同一種蛋白作用的結果不同，導致不同蛋白酶酶解的蠶蛹蛋白多肽分子量及自身結構具有差異，清除DPPH·的能力也有所區別，因此表現的清除能力不同。堿性蛋白酶的多肽得率為13.99%比獼猴桃蛋白酶的高，但后者DPPH·清除率卻比堿性蛋白酶的高，表明了多肽含量的高低并不能決定清除能力的強弱。

2.2.2 O2-·清除性能研究

O2-·是氧基態接受電子形成的一個氧自由基，經過一系列反應容易形成其他有害的氧自由基，與多種疾病有著密切聯系，因此清除其對于蛋白酶解產物抗氧化性的表現有著重要作用。酶解產物的O2-·清除能力的測定結果如圖3 所示。

圖3 蠶蛹蛋白酶解多肽對O2-·清除率Fig.3 Clearance rate of silkworm chrysalis proteolytic polypeptide to O2-·

由圖3 可知，堿性蛋白酶酶解產物的清除率最高為43.69%，木瓜蛋白酶酶解產物最低為14.65%。結合多肽得率的測定結果，可能的原因是木瓜蛋白酶多肽得率偏低，酶解產生的生理活性肽較少，影響了O2-·自由基的清除能力。

2.2.3 總還原能力研究

還原力是體現酶解產物提供電子能力的重要指標，自由基通過結合酶解產物提供的電子變成穩定的分子，從而失去活性，酶解產物表現出抗氧化作用。酶解產物還原能力的測定結果如圖4 所示。

圖4 蠶蛹蛋白酶解多肽的總還原能力Fig.4 The total reduction ability of silkworm proteolysis polypeptides

由圖4 可知，8 種蛋白酶酶解產物都具有一定的還原能力，堿性蛋白酶酶解產物其還原能力最高為1.982，酸性蛋白酶的最低為0.852，可能的原因是堿性蛋白酶等的酶解產物提供電子的能力優于酸性蛋白酶酶解的，從而使自由基變為穩定物質失去活性，阻斷了自由基的鏈式反應，發揮了較強的抗氧化作用。另一個可能的原因是，酸性蛋白酶反應緩沖液的pH值低，對酶解產物的活性有所改變，影響了其還原能力。

2.2.4 金屬離子螯合力研究

亞鐵離子會加速脂質的氧化過程，因此可以通過測定酶解產物對金屬離子的螯合力來評價其抗氧化性。金屬離子螯合力的測定結果見圖5。

圖5 蠶蛹蛋白酶解多肽金屬離子螯合能力Fig.5 Chelating ability of silkworm protease polypeptide to metal ions

由圖5 可以得出，8 種蛋白酶酶解產物都具有一定的金屬螯合能力，蛋白酶酶解產物其螯合力最高為0.624，風味蛋白酶的最低為0.221，可能的原因是堿性蛋白酶酶解產物中含有較多的氨基羧酸類或是羥基羧酸類物質，而這類物質有較強的金屬螯合力，因此螯合金屬離子的能力較強，風味蛋白酶酶解產物中的含有的這類物質較少，其螯合力較弱。

2.2.5 綜合抗氧化性能分析

試驗利用8 種蛋白酶分別對蠶蛹蛋白進行酶解，測定了酶解產物對DPPH·、O2-·的清除能力，比較了總還原能力和金屬離子螯合力的大小，較全面的評價了繅絲后脫脂蠶蛹蛋白多肽的抗氧化活性，結果表明：在加酶量一定的前提下，獼猴桃蛋白酶酶解產物對DPPH·清除率最高為42.34%，堿性蛋白酶酶解產物對O2-·清除率最好43.69%，總還原能力堿性蛋白酶酶解產物最高為1.982，金屬離子螯合力堿性蛋白酶酶解產物最佳為0.624。試驗結果還揭示了酶解產物多肽得率的高低與其抗氧化能力并沒有正相關性，這可能與各種酶的酶切位點不同相關，導致生成多肽的大小和含量有差異，酶解多肽氨基酸的結構和組成也不盡相同，致使其抗氧化活性能力差異較大，為下一步多肽的具體分析奠定了基礎。

3 結論與討論

以繅絲后的蠶蛹蛋白粉為原料，分別選用中性蛋白酶等進行水解，以DPPH·清除率、O2-·清除率、總還原能力、金屬離子螯合力等作為檢測抗氧化活性的指標，較全面的評價了酶解產物的抗氧化活性。發現了堿性蛋白酶酶解得到的產物表現出了較好的綜合抗氧化的能力，DPPH·清除率為38.91%，O2-·清除率為43.69%；總還原能力為1.982，金屬離子螯合力為0.624。

據文獻報道蠶蛹酶解產物多肽有著明顯的自由基清除能力及抗氧化性。包立軍等[25]以DPPH·清除率為指標，研究了天然家蠶及蠶絲酶解的多肽活性，實驗得出DPPH·清除率平均為62.26%；左振宇等[26]選用堿性和中性蛋白酶作為最適水解酶，在最適條件下酶解得出多肽得率33.29%，O2-·清除率為40.57%，但是其采用超聲處理的方法可能會對產物多肽的活性造成一定的影響，賈俊強等[27]采用堿性蛋白酶酶解蠶蛹蛋白，制備了血管緊張素轉換酶抑制肽（Angiotensin converting），并得出了酶解產物對ACE 的抑制率達96.67%；劉曼麗[28]采用體外消化模型對蠶蛹蛋白進行了處理，制備了消化多肽，并對其抗氧化活性和抗腫瘤活性進行了研究；王偉等[29]研究表明混合蛋白酶水解得到的蠶蛹多肽具有良好的抗氧化活性。本文選用8 種蛋白酶，對繅絲后脫脂蠶蛹粉進行酶解，采用4 種抗氧化能力檢測體系較全面分析了酶解產物的綜合抗氧化性，為進一步深入研究蠶蛹酶解多肽的生理活性奠定了基礎。作為抗氧化產品，酶解蠶蛹活性肽可以作為補充膳食的功能食品和化妝品添加劑，將體現出越來越高的價值。大力發展蠶蛹活性肽的研發和生產可以推動當地蠶絲產業的轉型和振興，促進當地經濟快速發展。