光學生物傳感器在致病菌檢測中的研究進展

許思齊，金敏

（1.山東農業大學生命科學學院，山東泰安271018；2.山東農業大學農學院，山東泰安271018）

食物中的微生物病原體導致的食源性疾病，對人類的健康造成了嚴重的威脅。隨著疫苗和抗生素的發展與應用，早期的疾病雖可以得到治愈，但新型的與耐藥性的病原體仍不斷涌現[1]。此外，目前致病菌的診斷方法效率低，速度慢，特別是在資源有限的地區，仍然難以找到合適的解決辦法。因此，需要發展更快速，準確，多元化的診斷方法，且不需要復雜的檢測步驟和昂貴的分析儀器。以培養為基礎的傳統分析方法，即“金標準方法”，本質上耗時耗力，且因致病菌侵襲范圍的擴大而愈加復雜。這也導致以培養為基礎的致病菌檢測系統的靈敏度顯著降低[2]。因此，研發具有多路復用、靈敏度高、特異性好和成本低等特點的致病菌診斷系統是今后研究的重點。

基于納米技術的生物傳感器與傳統檢測方法相比具有許多優勢，包括高通量篩選、無標記檢測、實時分析、低檢測限（limit of detection，LOD）和低樣本量等特征。隨著納米生物技術的發展和進步，各種類型的結合受體與配體，理化方法和納米技術已經被廣泛應用于生物傳感器的開發，為提高致病菌檢測性能提供了新思路。目前已經開發出了基于電子[3]，電化學[4]，機械[5]，核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）[6]和光學傳感[7]等技術的各種致病菌檢測生物傳感器。其中，可視化光學生物傳感器，特別是比色傳感器，更加易于使用，且檢測效率高，便攜，成本低。此外，光學生物傳感器中的等離子體生物傳感器具有優異的靈敏度和復用能力。這些獨特的優勢已經使光學傳感器商品化步伐不斷加快。

近年來，在致病菌檢測領域的一個重要發展趨勢是開發用于現場即時檢測的可視化生物傳感器。隨著微流控和光學一體化技術的不斷發展，開發現場即時檢測系統變得更加可行。此外，前人已對基于智能手機系統研發的既有光源又有光檢測器的生物傳感器研究開發多年，既可以提供簡單使用界面又可以實現快速檢測。它不僅為發展中國家提供更加簡便、廉價和高效的診斷系統，還能應用于醫療保健、食品安全和環境監測等方面[8]。因此，相信可視化光學傳感器在未來的致病菌診斷和現場即時護理點（point-of-care，POC）監測中必定會占據更加重要的地位。

1 比色光學生物傳感器

比色生物傳感器是一種極具吸引力的光學生物傳感器系統，因為人們可以輕松地通過反應液顏色的變化，無需任何分析儀器，即時地用肉眼觀察到樣品中致病微生物。比色生物傳感器通常分為基于平板和溶液的兩種表現形式?；诩垙埡筒ＡУ钠桨逍问降膫鞲衅饔捎谄洳僮骱唵魏头治鰳悠妨啃《邮艿角嗖A。作為具有代表性的產品，以側流層析檢測（lateral flow assay，LFA）為基礎的生物傳感器目前在市場上非常普遍。例如，杜邦公司生產的基于LFA 的生物傳感器，金標檢測卡可以在10 min 內通過特異性抗體檢測大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌和李斯特菌。生物梅里埃公司設計的產品可在15 min 內檢測出鏈球菌和嗜肺軍團菌。這些產品都是利用了樣品在濾紙或膜中因毛細作用流動擴散以及通過金納米顆粒（gold nanoparticles，Au NPs）聚集而產生顏色的變化。

然而，基于LFA 的生物傳感器主要存在的缺點是靈敏度較低[9]。目前較為常用的方法是通過放大信號來提高靈敏度，例如，Hossain 等[10]使用磁珠預濃縮菌體細胞。此方法是將受體附著在磁珠上，從磁鐵樣品中分離出目標致病菌細胞，使分離的細胞通過重新懸浮在任何所需檢測的體積中而實現易于濃縮的目的。該方法可使細胞濃縮10 倍～100 倍，從而能夠在30 min內診斷出檢測限為5 CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7，如圖1 所示。

圖1 基于LFA 的比色傳感器[10]Fig.1 The colorimetric biosensor based on the LFA[10]

Hadi 等[11]提出一種基于磁珠聚合且與手機攝像頭相連的生物傳感器。利用該傳感器系統，不僅能夠用肉眼檢測出樣品中的大腸桿菌，還能在計算機上使用手機攝像機和數字成像分析軟件進行半定量分析，LOD 值可低至8 CFU/mL?；贚FA 的傳感器的另一個局限性是多重檢測的能力受限[12]。若想在一個單一的平板基片上進行多重分析檢測，需要研究人員積極研發新型的制造工藝來固定特異的受體。此外，還有多種制作方法，包括光刻、噴墨印刷、等離子蝕刻和蠟印刷等[13-15]。這些制作工藝通過在親水性多孔紙基中創建物理或疏水的通道屏障，制作出多種的2D 或3D分析檢測裝置[16]?；谡奂埖闹谱鞣椒尚纬啥鄠€微斑點和圖層，其具有不同的模式，因每層的吸液率不同，從而實現對分析物進行多重分析與半定量測定[17]。

另一種形式是基于溶液體系比色生物傳感器。Tram 等[18]提出了一種簡單而成本低廉的細菌檢測方法，見圖2。該方法利用細菌特異性RNA 切割DNA 酶探針作為分子識別元件，利用脲酶水解尿素來提高檢測液的pH 值，通過將脲酶與磁珠上的DNA 酶偶聯，將細菌的檢測轉化為pH 值的增加，更易于隨后的石蕊染料或pH 值試紙的比色檢測，雖然該方法操作簡單，價格低廉，但靈敏度較低（5×102CFU/mL，1 h 和 5×103CFU/mL，2 h），因此如何提高靈敏度是比色生物傳感器檢測致病菌的關鍵點。

圖2 基于溶液體系的比色傳感器[18]Fig.2 The colorimetric biosensor based onsolution system[18]

2 等離子體光學生物傳感器

近年來在致病菌檢測的發展及應用中，等離子體生物傳感器由于靈敏度和特異性高以及儀器和操作的簡易性發展勢頭迅猛。其中最主要的兩類等離子體生物傳感器是表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）和表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）[18-19]。

SPR 傳感器因其穿透金屬表面的深度有限，及細菌細胞質與水介質折射率相似，限制了其檢測較大體積的物體（如整個微生物細胞），通常靈敏度較低（LOD約為1.0×103CFU/mL）。經過前人的不斷探索，目前SPR 生物傳感器的靈敏度已經明顯提高。Torun 等[20]提出一種結合磁性納米顆粒的SPR 傳感器進行磁分離的檢測大腸桿菌的方法，最檢測限可低至3 CFU/mL。Yoo 等[21]應用局部表面等離子體共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）對金納米顆粒（gold nanoparticles，Au NPs）結構進行修飾從而實現單一傳感器同時識別3 種不同的致病菌的突破，檢測限（limit of detection，LOD）為 30 CFU/mL。Kim 等[22]開發了一種用 Cu代替Au 作為外殼材料，并由核心結構表面有序排列二氧化硅納米顆粒制作而成的LSPR 傳感器，且超靈敏地檢測到LOD 為10 fM 的致病菌的DNA，其原理圖如圖3 所示。

圖3 基于SPR 的傳感器[22]Fig.2 The plasmonic biosensor based on the SPR[22]

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）因其靈敏度可達到單分子水平，特異性好以及對淬火不敏感性已廣泛用于致病菌檢測方面的研究[18]。目前大多數表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）生物傳感器都需要體積龐大的光學元件，如光學顯微鏡、激光器、單色儀和探測器等。因此，今后的研究應著力于開發簡單小型化的表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）生物傳感器。SERS 生物傳感器的另一個局限性是樣品中致病菌的定量檢測。這取決于SERS 的性質，即拉曼信號的增強程度取決于金屬表面的納米級尺寸的粗糙度。Kang 等[23]研制了一種可作為特異且靈敏的多通路DNA 傳感器的金顆粒在線系統。由多個金納米線傳感器形成的圖案為每個傳感器提供相應的位置與標識。利用該系統，可以定量檢測目標DNA，檢測限為10 pM。該傳感器系統成功地識別了參考致病菌與臨床分離物中的目標物DNA，為傳染病的診斷提供了依據。Kearns 等[24]利用磁分離和SERS 技術，研制了一種分離和檢測多種致病菌的新型生物傳感器。這種新的檢測方法涉及到使用凝集素功能化磁性納米顆粒從樣品基質中捕獲和分離細菌，然后使用SERS 活性納米顆粒特異性地檢測細菌病原體，其原理如圖4 所示。

圖4 基于SERS 的傳感器[24]Fig.4 The plasmonic biosensor based on the SERS[24]

此研究可檢測3 種致病菌單一和混合的樣品——大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，每種細菌的最低檢測限可達101 CFU/mL。這為未來的致病菌多重檢測的研究與發展提供了理論依據。致病微生物還可通過層次聚類分析來進行識別。聚類分析是利用了細菌細胞壁的組成成分（多糖，蛋白質，脂質，核酸等）來顯示不同的SERS 譜的特征。因此，病原微生物不同的細胞壁成分使其SERS 光譜“特征”表現不同。但因對分析軟件和致病菌標準的表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）數據庫有較高要求，SERS 生物傳感器應用于致病菌的檢測仍然任重而道遠。

3 微流體光學生物傳感器

近年來，微流控技術的快速發展，使其被廣泛應用于各種光學生物傳感器中用以檢測致病微生物。生物傳感器與微流體集成的檢測系統能夠在單一設備上進行樣品的添加、分離、制備和分析，其具有成本低、檢測時間短、多通量、自動化、便攜性，多功能性和所需樣品量小等多種優點[25]。從復雜樣品中有效分離致病菌對于精確檢測病原體至關重要，同樣也是今后疾病控制和食品、環境監控的需求。近年來，研究人員對集成光學生物傳感器越加重視。例如Lee 等[26]研發了一種利用磁性納米粒子組（magnetite nano clusters，MNCs）和三維印刷螺旋微通道裝置來檢測大腸桿菌的分析方法。用抗體功能化的磁性納米粒子組（magnetite nano clusters，MNCs）捕獲牛奶中的大腸桿菌，使用永久磁鐵將游離的MNCs 和MNC-菌體復合物從牛奶中分離出來，然后將該溶液注入螺旋微通道裝置中，通過分光光度法測定大腸桿菌的濃度，該方法緩沖液中檢測限為101CFU/mL，牛奶中檢測限為102CFU/mL。三維印刷螺旋微通道傳感器見圖5。

圖5 三維印刷螺旋微通道傳感器[26]Fig.5 The 3D-printed microfluidic biosensor device[26]

此外，科研工作者也努力研發自動化與微型化的生物傳感器檢測系統。例如，Ramalingam 等[27]開發的能夠在微流控芯片中對聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）進行耦合的熒光傳感器能夠實時檢測各種病原體的DNA，如圖6 所示。

圖6 熒光微流控芯片傳感器[27]Fig.6 Fluorescence microfluidic chip biosensor[27]

高精確控制溫度是微流控PCR 的一個重要研究課題，并且最近開發了基于微流體的等溫循環PCR 裝置，如核酸序列依賴性擴增技術（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）和環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP）[28-29]。在某些情況下，微流控裝置會被設計成多隔板式結構，用于多重檢測不同的致病微生物。Foudeh 等[30]研發了一種針對嗜肺軍團菌的快速、高特異性和靈敏性的檢測方法，主要是由于基因的16S rRNA二級結構，通過核糖體碎片和量子點增強檢測信號，增加了檢測系統的靈敏度。此方法可以檢測菌體16S rRNA 基因溶液濃度為102pM，體系為45 002 μL 的樣品，可直接、即時、有效地檢測人工水系統中的嗜肺軍團菌。目前，越來越多的研究者將無線網絡粘合劑裝置組裝在結構化的電子微流控基底上來監測生物傳感器的檢測結果，并將數據實時傳輸到手機或計算機系統[31]。各種用于檢測致病菌的光學生物傳感器的研究實例見表1，各種用于檢測致病菌的光學生物傳感器的優缺點及改進措施見表2。

表1 各種用于檢測致病菌的光學生物傳感器的研究實例Table 1 Research examples of various optical biosensors for the detection of pathogenic bacteria

續表1 各種用于檢測致病菌的光學生物傳感器的研究實例Continue table 1 Research examples of various optical biosensors for the detection of pathogenic bacteria

表2 各種用于檢測致病菌的光學生物傳感器的優缺點及改進措施Table 2 Pros cons and improvement of various optical biosensors for detection of pathogenic bacteria

4 結論

目前，用于致病菌檢測的可視化集成光學生物傳感器已得到極大的發展，展現出廣闊的應用前景，同時也存在一些尚未解決的問題。在高通量模式下應用于大量臨床和環境樣本的致病菌檢測光學生物傳感器方面的文獻較少。此外，致病微生物的多樣性，使檢測系統難以有效地覆蓋全部目標物。因此，開發高效的檢測系統是致病菌檢測與診斷發展的重要方向，需要科研人員不斷地探索與光學生物傳感器系統有關的各種新方法、新策略。例如，將已有的檢測方法與分析設備結合開發出更為先進的診斷設備，提高其靈敏度與特異性，尤其是無線通信集成的光學生物傳感器在致病菌診斷系統應用方面的前景非?？捎^?；谛滦图{米技術的光學生物傳感器正推動致病菌的檢測設備趨向于小型化、簡單化、成本低廉、高通量和集成多元化發展。憑借可視化光學生物傳感器的諸多優勢，這類傳感器必定會在臨床研究、食品安全、環境監測、病理分析、法醫鑒定等領域發揮巨大的應用價值并在現場即時檢測系統中占有具有極其重要的地位。