不同堿煮時間對玉米快速提取DNA效果的影響

付求來 吳潔 朱先飛

摘? 要：隨著SSR分子標記技術在玉米室內測純、一致性及真實性鑒定等方面的應用，該技術已經逐漸成為種子企業質量檢測后控的基本手段。但由于其檢測量大，準確性要求高的特點，使其對DNA提取質量的要求增加。該文以快速DNA提取方法為基礎，在普通的實驗條件下，設置4種不同沸水浴的堿煮時間，比較提取DNA后的電泳效果，尋求適合一般種子企業實驗室SSR分子試驗要求的DNA快速提取方法，為種子企業的快速質量測定奠定基礎。

關鍵詞：SSR;DNA快速提取;堿煮時間

中圖分類號 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0020-3

Abstract：With the use of SSR technology in the aspects of corn chamber test purity，consistency and authenticity identification，this technology has gradually become the seed enterprise quality testing after the control of the basic means.Due to its high detection quantity and high accuracy，the requirement of DNA extraction quality is increased.In this paper，based on the previous human rapid DNA extraction method，under the general experimental conditions of seed enterprises，four different boiling water bath alkali boiling time was set to compare the effect of DNA extraction after electrophoresis，to find a suitable method for rapid DNA extraction in the laboratory of seed enterprises，so as to lay a foundation for rapid quality determination of seed enterprises.

Key words：SSR;Rapid DNA extraction;Alkali boiling time

近些年來，由于分子標記技術具有明顯的多態性、共顯性、重復性等優點，已被廣泛應用于種子的純度、一致性、真實性檢測、分子標記輔助選擇以及轉基因檢測等方面，其中SSR分子標記技術應用最廣。而在整個SSR試驗過程，從DNA提起到擴增再到電泳，DNA提取是整個技術過程的前提和關鍵，如何提取質量較好的DNA，將影響到后面擴增環節，并最終影響到電泳的結果。前人的研究中，李榮華[1]通過改進CTAB法提取高純度DNA;王艷[2]利用試劑盒進行DNA快速提取;郭景倫[3-4]的玉米單粒DNA快速提取方法簡單有效，被廣泛應用。利用種子胚乳進行堿煮，此方法極大地提高了檢測效率，尤其在種子企業的純度檢測方面應用最廣。易紅梅[5]針對種子胚、胚乳、芽鞘、苗等不同部位提取的DNA效果進行了比較研究，確定了不同部位提取最好DNA的最佳時間，為進一步推廣快提法奠定了基礎。

在郭景倫[1]的快提法中，采用的是96孔深孔板，一道電泳，效果明顯。而在實際操作中，為了更好地提高試驗的便利性及經濟性，通常采用普通PCR板（96孔、200μL），在不影響檢測結果的前提下，會涉及多道擴增產物一起電泳，以節約試驗成本。圖1所示的譜帶類型在日常電泳中經常遇到，帶型間的拖尾現象逐條加重，提取DNA的質量和純度都存在一定的問題[6]，影響帶型分析的準確性。

如何改進方法使其能夠滿足日常測純、一致性檢測等多重電泳的需要，本研究以郭景倫的快速提取方法為背景，針對一般實驗室的基本條件和實際操作情況，采用普通PCR板（96孔、200μL），多道引物電泳，比較不同堿煮時間對快速提取DNA效果的影響，探尋適合一般實驗室適用的檢測方法，為更加高效、準確的進行室內測純、一致性及真實性鑒定以及高通量的DNA指紋鑒定平臺提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料 試驗品種為農單476，農單476父本、農單476母本，由安徽豐大種業公司實驗室提供。試驗SSR引物由上海生工合成，儀器采用ZAG電泳分析儀。

1.2 DNA提取 利用刻刀取下一部分干種子的胚乳，放入96孔板（200μL）中，每孔加入DNA提取液A（0.2m/L NaOH）40μL，提取液B（0.17M/LTris-HCl）60μL，設定4種處理方式，分別按表1進行沸水浴。提取后的DNA放4℃冰箱保存留用。

1.3 PCR擴增 取DNA2.0μL進行擴增，每個處理組從20對核心引物中選定的擴增效果較好的3對引物進行擴增，采用10μL體系，其中包括：DNA模板2μL、DNTP1.6μL、buffer2μL、引物0.8μL、taq酶0.1μL、ddH2O3.5μL。SSR反應程序為：94℃預變性、5min、1個循環，94℃變性、30S，55℃退火、30S，72℃延伸、30S，共30個循環，4℃保存。

1.4 電泳及銀染 將擴增好的產物加入1μL溴酚藍指示劑，在4%PAGE丙烯酰胺凝膠中進行電泳，100w，25min，每塊膠點樣3道。電泳完成后取下玻璃板，在雙蒸水中快速漂洗一次，放入0.2%AgNO3中浸染10min后，再次漂洗1次后放入0.4%NaOH和0.5%甲醛的混合液中浸泡直至顯影。結束后對所有提取的DNA原液進行稀釋1倍，重復以上操作，且對處理1組分別進行PAGE凝膠電泳和毛細管電泳，比較兩者的應用效果。

2 結果與分析

2.1 不同煮沸時間對快速提取DNA效果的影響 利用快提法取用玉米種子胚乳，設置不同的煮沸時間提取DNA并進行PCR檢測。4個處理組，每個處理組擴增3個引物，每板膠點樣3道，效果如圖2所示。由圖2可知，在處理Ⅰ和Ⅱ中，擴增效果較好，每條帶型清晰，能夠進行帶型分析處理，但在處理Ⅲ和Ⅳ中，第1條帶效果清晰，第2條次之，第3條模糊，3條間已相互影響，且拖尾顯現逐次加重。

圖2表明，每個處理組間提取的DNA含量均較高，3條帶在有相互重復的區域都存在拖尾現象，且處理Ⅲ和處理Ⅳ最為嚴重，第3條帶正常的分析已受到影響。對比各處理間的第1條帶，差異不大，但隨著堿煮時間的延長，每個處理間在第2、第3條帶間呈現出拖尾程度不同的現象。當堿煮時間小于3min，即Ⅰ、Ⅱ處理，拖尾不明顯，帶型分析不受影響;當堿煮時間大于5min時，即Ⅲ、Ⅳ處理，拖尾現象逐條加深，帶型分析受到影響。說明了控制堿煮時間是影響DNA提取質量的關鍵。

分析不同煮沸時間引起的帶型差異，利用胚乳進行煮沸快速提取DNA，由于整個提取液中含有多糖、蛋白質、葉綠素等細胞內含物雜質以及一些化學物質，隨著煮沸時間的延長，細胞的破損程度增大，內含物的釋放量也隨之增大，整個提取液及擴增后的產物中含有的雜質也逐漸增多，影響擴增產物的正常電泳，致使多重電泳時，每條帶型間相互影響，影響讀帶的準確性。

2.2 快速提取DNA經稀釋后對擴增效果的影響 從圖1中發現，提取的DNA濃度過高且每個處理間都存在拖尾現象。在PCR擴增時若DNA含量足夠且能降低原液中各種雜質的含量，將能進一步提高電泳譜帶的清晰度。進而我們對提取的DNA原液進行稀釋1倍處理，重復試驗過程，凝膠電泳結果如圖3所示。由圖3可知，快速提取后的DNA原液經稀釋后，不同處理間擴增后電泳譜帶的清晰度增加，且拖尾現象不同程度的得到減輕。在處理Ⅰ、Ⅱ中，帶型清晰可辨，尤其在Ⅰ中，第3條帶依然不受影響。而在處理Ⅲ、Ⅳ中，雖帶型的清晰度增加，但沒有處理Ⅰ、Ⅱ中明顯，依然存在拖尾。說明了提取的DNA原液經稀釋后，DNA的含量能夠滿足SSR試驗的需要，且使單位體積內模板中雜質含量減少，電泳后譜帶的效果更加清晰。

2.3 快提DNA稀釋前后在毛細管檢測系統中的應用效果 對試驗中處理Ⅰ組的DNA原液分別進行稀釋前后的PCR擴增，然后放至毛細管系統中進行電泳，比較效果的差異。圖4、5表明，稀釋前的DNA經電泳后主峰明顯，峰值較高，但存在明顯非特異峰;經稀釋1倍后主峰較明顯，峰值適中，存在非特異性峰但不明顯，表明DNA原液稀釋后明顯的降低了非特異性峰的出現，使主峰更加清晰明辨。同時也證實了處理Ⅰ中提取的DNA可以用于毛細管系統檢測，但經稀釋后更適合毛細管帶型分析。

3 結論與討論

3.1 控制堿煮時間能有效提高快提法提取DNA的效果 通過切取種子胚乳進行快速提取DNA，能夠滿足日常檢測的需要，這與郭景倫、王風格[3]等的研究一致。通過在沸水中堿煮，能夠使細胞迅速破裂[7]，釋放出包含DNA在內的一些細胞內含物（多糖、蛋白質等雜質）[8]，為下一步DNA的擴增提供基礎，極大地提高了工作效率。但在一般種子企業實驗室中，涉及到多重電泳中出現的拖尾問題，為此，本研究設置4種不同的堿煮時間，比較多重電泳后顯影的效果。結果表明，在普通的PCR板（96孔，200μL）上堿煮時間3min內提取的DNA，多重電泳后拖尾現象不明顯，不影響正常帶型分析工作，但堿煮超過5min后，條帶間相互影響，拖尾現象嚴重。

同時，在對DNA原液稀釋后再次試驗，發現每個處理間的條帶清晰度增加，拖尾現象減輕，且堿煮時間在3min內的2組多重電泳后的條帶間幾乎不受影響。降低雜質含量是解決拖尾現象的關鍵，堿煮時間越長，細胞內含物的釋放越充分，提取的DNA中含有的雜質量越多，擴增及電泳受到的影響就越大。經稀釋后，各種雜質的含量比例降低，但DNA的含量仍能達到擴增的需要，最終電泳顯影后效果較好。對比分析表明，堿煮的時間長短影響了最終提取DNA的質量，針對普通PCR板，控制堿煮時間3min內，再進行稀釋1倍處理，電泳效果最好，不影響日常檢測工作的準確性。

3.2 切?？焯岱ㄔ诂F代檢測儀器中的利用 隨著快提法的推廣應用，不僅在純度、一致性及真實性檢測上提高了檢測效率，而且能夠在分子選育上使室內和田間有效的結合，胚沒有損傷的種子仍能種到田間觀察表現[9]。但隨著現代檢測儀器毛細管電泳[10]的使用，如高通量檢測儀器3730L、ZAG等，使得檢測準確率得到了極大的提升，同時也對擴增產物的質量提出了一定的要求。通過切粒沸水堿煮提取DNA，提取液中除了含有一些可溶類雜質外，其中仍含有切除不可溶解的胚或胚乳微粒，致使在擴增時吸取的DNA模板將會含有這些可溶或不可溶物質。由于毛細管電泳儀器的精密性，維護成本較高，結合儀器自身特性，細小的微?？赡軙斐擅毠芸锥氯?，增大儀器的使用風險。在日常利用毛細管的檢測中，盡可能的使用胚芽或葉片進行快提，前人的研究[5]已經證實，發芽3d左右的嫩葉提取的DNA完全滿足SSR的要求且適合毛細管系統檢測。切粒提取的DNA原液，可以對其進行1～1.5倍的稀釋，以降低模板不可溶物質的含量，在不影響檢測準確度的基礎上，盡量減少毛細管儀器的使用風險。

參考文獻

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（責編：張宏民）