入侵植物喜旱蓮子草對銅綠微囊藻的化感作用研究

程萌 李丹 張猛

摘? 要：為了探究控制微囊藻暴發以及喜旱蓮子草綜合利用的方法，以喜旱蓮子草（Alternanthera philoxeroides）為供體，銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為受體，利用喜旱蓮子草不同部位的乙醇浸提液對銅綠微囊藻進行室內控制培養，分析其生長狀態。結果表明：（1）與對照組相比，喜旱蓮子草乙醇浸提物對銅綠微囊藻的生長具有明的顯抑制作用，藻體數量降低36.95%～95.14%;微囊藻溶液相對電導率增加0.50%～29.19%;（2）微囊藻溶液葉綠素a含量隨著浸提物濃度增加呈現出不同的效應，在低濃度（c≤70g/mL）時表現為促進，葉綠素a含量增加19.41%～762.99%;高濃度（c>70g/mL）時表現為抑制，溶液中葉綠素a降低10.15%～75.94%;（3）除喜旱蓮子草地上部分浸提物在最高濃度（280g/L）影響下，微囊藻溶液COD增加12.43%外，而其他濃度處理（≤140g/L）使微囊藻溶液COD降低13.15%～66.84%;（4）通過比較不同指標的化感效應指數表明，喜旱蓮子草不同部位浸提液的化感作用強弱不同，表現為地下部分浸提物化感作用明顯強于地上部分。

關鍵詞：入侵生物;化感作用;浸提物;喜旱蓮子草;銅綠微囊藻

中圖分類號 Q948.12+2.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0032-4

Abstract：In order to explore resource utilization of a invasive plant and biological control of the Microcystis，indoor bioassay was adopted to study the allelopathic effects of a invasive plant，namely Alternanthera philoxeroides，on Microcystis aeruginosa. The results show that：（1）The ethanol extracts of A. philoxeroides significantly inhibited the growth of M. aeruginosa significantly，and the extracts reduced the number of M. aeruginosa by 36.95%-95.14%;the relative electric conductivity of M. aeruginosa increased 0.50%-29.19%;（2） the concentration of the ethanol extraction of A.philoxeroides has significant difference on the chlorophyll of Microcystis solution，the change of chlorophyll under different controls shows a trend of promotion in low concentration （c≤70g/L） and inhibition in high concentration（c>70g/L） content;（3） the effect of 280g/mL extract of aboveground organization of the host plant had more significant difference on COD of Microcystis solution than others，the COD of the solution under 280g/mL increased by 12.43%，while the index under other controls decreased by 13.15% to 66.84% compared with the control;（4） compared with RI of different controls of the extracts of A. philoxeroides，the inhibition of allelopathy from belowground organizations was stronger than of allelopathy from aboveground parts at the same concentration.

Key words：Invasive species;Allelopathic effect;Ethanol extraction;Alternanthera philoxeroid;Microcystis aeruginosa

喜旱蓮子草（Alternanthera philoxeroides），又名空心蓮子草，俗稱“水花生”，為莧科、蓮子草屬多年生宿根性草本植物。該物種原產于巴西，其生命力頑強，適應性強，廣泛分布于多個國家和地區[1]。20世紀30年代引種至中國，目前已經在我國28個省市區均有分布[2]。由于其自身的生物、生態學特性，該植物生長迅速，具有明顯的競爭能力，易于對入侵地的生態環境、生產生活等產生負面影響[3-4]。

近年來，針對該入侵植物的綜合利用與防治的研究，越來越引起人們的關注[5]。喜旱蓮子草常被用作肥料、動物飼料，食用菌培養基原料也可作為生物質能源發展沼氣，同時可以用于水質凈化。研究表明，喜旱蓮子草通過其植株的化感作用[6-8]，影響其他生物的生長。

現階段，隨著我國水體富營養化程度的加劇，在巢湖、滇池等湖泊中“水華”暴發頻繁，有害藻中以藍藻和綠藻在數量和發生頻率上均占有優勢[9]，在藻細胞死亡或細胞膜通透性增強時會向水中釋放藻毒素，破壞水質，導致生態系統失衡，危害人體健康[7]。因此，如何抑制藍藻的生長、控制水體富營養化已成為水污染治理的研究熱點和亟待解決的問題。為此，國內外很多研究者進行了相關研究，開展了控制水華暴發不同方法的研究[10]。筆者在野外進行巢湖水體污染水體狀況調查中發現，在喜旱蓮子草密集生長水體中藍藻數量普遍較少甚至沒有。據此，筆者假設喜旱蓮子草的化感物質對藍藻的發生具有一定的影響，存在一定的抑制作用。

本實驗以入侵植物喜旱蓮子草為供體，以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為受體，研究喜旱蓮子草不同器官乙醇浸提物對于其生長的影響，為綜合利用入侵植物喜旱蓮子草以及控制微囊藻引發的水華現象等方面研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料選擇 2013年8月，在合肥市蜀山區四里河路至潛山路南淝河段岸邊挖取喜旱蓮子草完整植株，洗凈晾干，分揀地上與地下部分備用。2013年8月，在安徽巢湖第4取水口撈取藍藻，稀釋20倍后在顯微操作臺上分離出銅綠微囊藻備用。

1.2 研究方法

1.2.1 微囊藻培養 選擇培養藻類常用BG-11培養基[7]。將100mL培養基置于250mL錐形瓶中，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌處理15～20min，向培養基內加入已分離出的銅綠微囊藻，然后放入人工氣候箱，溫度（25±1）℃、光照2000lx、光周期16L∶8D，對微囊藻進行擴大培養，每天晃動2次。

1.2.2 制備喜旱蓮子草浸提物 將分離完成的喜旱蓮子草地上部分和地下部分分別置于烘箱內105℃烘干，粉碎。參考文獻提取方式，取70g干物質通過100mL 95%乙醇利用索式提取器進行提取，將提取液過3層紗布過濾處理放入旋轉蒸發儀蒸發至膏狀，密封，置于4℃冰箱內保存待用。

1.2.3 材料處理及培養 將BG-11培養基100mL放置于250mL滅菌過的錐形瓶，加入擴大培養的銅綠微囊藻溶液3mL，再次擴大培養14d。將喜旱蓮子草的地上、地下部分浸提物物用75mL蒸餾水配置成母液（280g/L），然后稀釋成140g/L、70g/L、35g/L、17.5g/L等不同濃度溶液，實驗中設置蒸餾水做空白對照組（0g/L）。實驗共設置11組處理，每組5個重復。分別取以上11組溶液3mL加入到微囊藻溶液中，每天搖動3次。實驗過程中為避免灰塵及其它微生物的干擾，對使用材料均進行滅菌處理，且均在無菌條件下進行操作，繼續培養14d后，觀察其生長狀況并測定其生長指標。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 藻溶液銅綠微囊藻數量 采用顯微鏡計數法，取培養后的藻溶液1mL，稀釋20倍后用血球計數板計數測定銅綠微囊藻數量。每重復組取樣計數3次，取平均值作為該重復組樣品計數結果。

1.3.2 藻溶液相對電導率 取5mL混勻的藻溶液，在室溫下測定其電導值S1（DDS-12A型電導儀（上海）），再將上述試管置于水浴鍋加熱（100℃）30min，冷卻至室溫，測定其電導值S2，最后計算葉片相對電導率。計算公式為：

相對電導率（%）=S1/S2×100 [11] （1）

1.3.3 藻溶液葉綠素a含量 分別取各處理組藻溶液2mL分別置于10mL離心管中，于12000離心5min，用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL 80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55℃水浴放置30min，后于12000rpm離心5min，吸出上清液轉移至10mL刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL，測定663nm處的光吸收值，測定結果按照CA=OD663/82，計算溶液葉綠素含量（mg/L）[6]。

1.3.4 藻溶液COD的測定 將經過處理的微囊藻溶液進行40倍稀釋，并取20mL稀釋后的微囊藻溶液置于250mL磨口的回流錐形瓶中。通過重鉻酸鹽法（GB/T11914—1989）測定微囊藻培養液COD。

1.3.5 化感效應評價 參照Williamson等的方法進行浸提物化感效應評價[12]，即：

RI<0表明為抑制作用，RI>0表明為促進作用，絕對值的大小表示化感作用的強弱。

1.4 數據分析 本實驗中所有數據均使用Excel 2003整理，通過SPSS 17.0軟件進行LSD多重比較與單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 喜旱蓮子草浸提物對銅綠微囊藻數量的影響 由表1可知，與對照組相比，喜旱蓮子草浸提物對銅綠微囊藻數量具有顯著的化感抑制作用（P<0.05，RI<0），且各處理組之間具有顯著差異（P<0.05）。喜旱蓮子草地上部分浸提物使銅綠微囊藻數量降低50.55%～95.14%，而該植物地下部分浸提物使微囊藻數量降低36.95%～92.73%。通過化感效應指數分析，發現喜旱蓮子草不同部位浸提物對銅綠微囊藻數量均具有明顯抑制作用，且抑制強度隨著喜旱蓮子草浸提物濃度的升高而增加。

2.2 喜旱蓮子草浸提物對藻溶液葉綠素a含量的影響 通過測定喜旱蓮子草浸提物處理的微囊藻溶液內葉綠素a含量，表明不同部位浸提物對微囊藻溶液的葉綠素a含量有明顯影響作用（表2）。其中，喜旱蓮子草地上部分的浸提物在低濃度時（c≤70g/L）使微囊藻的葉綠素a增加64.24%～762.99%，而在高濃度時則使微囊藻的葉綠素a降低51.67%～60.03%。與對照相比，喜旱蓮子草地下部分的乙醇浸提物在較低濃度（c≤70g/L）時葉綠素含量增加19.41%～26.50%，較高濃度（c>70g/L）時微囊藻的葉綠素含量降低10.15%～75.94%。從化感效應指數來看，喜旱蓮子草浸提物均在低濃度時促進了溶液葉綠素a含量的提高，而在高濃度處理條件下則表現為抑制作用。表明隨著該入侵植物浸提物濃度的增加，微囊藻溶液葉綠素a含量呈先降低后增加的趨勢。

2.3 喜旱蓮子草浸提液對微囊藻溶液相對電導率的影響 微囊藻溶液的相對電導率在浸提物濃度增加的過程中表現為逐漸降低（表3）。與對照相比，喜旱蓮子草地上部分浸提物使微囊藻的相對電導率增加2.92%～29.19%;而地下部分浸提物使微囊藻的相對電導率增加0.50%～11.82%。通過化感效應指數，喜旱蓮子草不同部分乙醇浸提物相同濃度處理下，地上部分對微囊藻相對電導率的化感作用較強。

2.4 喜旱蓮子草浸提液對微囊藻溶液化學需氧量的影響 由表4可知，與對照組相比，隨著喜旱蓮子草地上部分乙醇浸提物濃度的增加，微囊藻溶液COD呈現先降低后增大的趨勢，而地下部分浸提物濃度的下降，使微囊藻溶液COD呈現降低的趨勢。各處理間相比，除喜旱蓮子草地上部分浸提物在最高濃度（280g/L）影響下微囊藻溶液COD增加了12.43%以外，而其他濃度處理（≤140g/L）使微囊藻溶液COD降低13.15%～66.84%。通過化感效應分析表明，除地上部分在280g/L濃度處理時使溶液COD增加即表現為化感促進作用外，其余處理條件下均為化感抑制作用（RI<0）。

4 結論與討論

藻類數量的大小是最能反映藻類生長狀況的一個指標[13]。本研究中發現：喜旱蓮子草浸提物對溶液內微囊藻數量具有明顯的抑制效應，浸提物濃度越低，則微囊藻數量降低的幅度越大。這可能是由于浸提物中所含有的部分有機物達到一定濃度時，通過固定藻類細胞使其失去生命活力，也可通過降低藻類光合作用而抑制藻類生長最終殺滅藻類細胞[13]。另外，喜旱蓮子草浸提物的添加可能遮擋了微囊藻溶液的部分光照，導致實驗過程中光強下降，降低光合水平，從而對藻類生長產生抑制作用[14]。

葉綠素是光合作用的原料[15，16]，藻類葉綠素含量的高低直接反映出藻類生長中光合作用程度的高低。通過藻類抑制實驗，可作為評價受試物對藻類的“短期抑制效應”的指標[16]。而藻類進行光合作用的物質基礎葉綠素a表示光合作用的強弱，用于表征藻類的存活狀況及生物量的大小[17]。本實驗中，喜旱蓮子草浸提物在低濃度時增加微囊藻溶液葉綠素a含量，而在較高濃度時則會抑制葉綠素a的含量。這是由于當喜旱蓮子草浸提物濃度增加到一定程度時，會產生聚集成團的現象，會超出藻細胞的自我調節能力，造成葉綠體結構的破壞，從而影響藻類生長[7]。該實驗中發現低濃度浸提物會促進藻類葉綠素a的含量，這可能是由于浸提物刺激了微囊藻體內某些酶的活性，從而促進了藻類的生長[18]。

相對電導率是反應細胞膜系統狀況的一個重要生理生化指標[19]，往往在植物受到脅迫時，會導致相對電導率的變化。受環境脅迫越大，細胞膜透性增大，電解質等物質滲漏，進而引起組織的電解率發生變化，從而電導率越大[20]。因此，藻類細胞膜通透性的增加可以作為衡量植物脅迫程度的指標。本研究中發現，喜旱蓮子草浸提物使微囊藻溶液的相對電導率顯著增加，這可能是由于藻類在逆境狀態下細胞膜容易受到損傷而破裂，進而導致細胞液外滲而增大相對電導率。

化學需氧量可以作為反應水中還原物質多少的一個指標，水中主要的還原物質為有機物、亞硝酸鹽、硫化物等?；瘜W需氧量越小，表明水污染程度越輕[21-22]。本研究中發現，在喜旱蓮子草浸提物處理條件下微囊藻溶液的COD顯著下降，這可能是由于喜旱蓮子草浸提物影響藻類生長，從而降低了水中有機物的含量。

外來種一般都有較強的適應性和寬廣的生態幅，從而能夠在入侵地生態系統中成功入侵[23-24]。目前的研究表明，石菖蒲、梭魚草、大薸等植物對銅綠微囊藻具有明顯化感效應[17，19，25]，同時也發現喜旱蓮子草對不同植物也表現出明顯的化感作用[6，26]，這為探討該入侵植物的綜合利用與防治提供了很好的思路和切入點。本研究發現，喜旱蓮子草浸提物對銅綠微囊藻具有一定的化感抑制作用，但該入侵植物的化感物質是否能夠成為防治藍藻的有效措施，還需要進一步深入分析化感抑制作用的活性物質及其作用機制，從而更好地為喜旱蓮子草的綜合利用以及藍藻的生態控制提供理論支持。

參考文獻

[1]李潔，蔣娜，范雪濤，等.空心蓮子草化感效應的初步研究[J].種子，2007，26（12）：32-35.

[2]陳立立，余巖，何興金.喜旱蓮子草在中國的入侵和擴散動態及其潛在分布區預測[J].生物多樣性，2008，16（6）：578-585

[3]林金成，強勝，吳海榮.外來入侵雜草空心蓮子草對植物生物多樣性的影響[J].農村生態環境，2005，21（2）：28-32

[4]張震，徐麗，朱曉敏.喜旱蓮子草對不同生境植物群落多樣性的影響[J].草業學報，2010，8：10-15

[5]李丹，徐麗，張震，等.喜早蓮子草的利用及其生物防治研究進展[J].中國農學通報，2013，29（01）：71-75.

[6]張震，徐麗，馬艷婷.喜旱蓮子草組織水浸提液對黑麥草種子和幼苗的化感效應[J].西北植物學報，2009，29（1）：0148-0153.

[7]田如男，孫欣欣，魏勇.不用類型水生植物群落對銅綠微囊藻的化感作用[J].生態環境學報，2010，19（9）：2149-2154.

[8]林金成，強盛，吳海榮，等.水花生[Alternanthera philoxeroides（Mart.）Grised][J].雜草科學，2003（3）：36-38.

[9]葉良濤，錢家忠，左勝鵬，等.不同營養水體對喜旱蓮子草化感抗藻的影響[J].草業學報，2012，21（2）：279-284.

[10]周笑白，張寧紅，張詠，等.太湖藍藻的時空變化規律及治理方法[J].生態環境學報，2013，22（12）：1930-1935.

[11]陳建勛，王曉峰.植物生理學實驗指導（第二版）[M].廣州：華南理工大學出版社，2006：64-66.

[12]Williamson G B，Richardson D. Bioassays for Allelopathy：Measuring Treatment Responses with Independent Control[J].Journal of Chemical Ecology，1988，14（1）：181-187.

[13]馬艷芝，王向東.青苔去除劑對溫室盆花栽培基質中藻類數量的影響[J].江蘇農業科學，2009，1：161-163.

[14]朱小山，朱 琳，田勝艷，等.三種金屬氧化物納米顆粒的水生態毒性[J].生態學報，2008，28（8）：3507-3516.

[15]賈若凌.銅脅迫對菊芋幼葉生理生化指標的影響[J].河南農業科學，2012，41（8）：154-156.

[16]Aruoja V，Dubourquier H C，Kasemets K，et al..Toxicity of nanoparticles of CuO，ZnO and TiO2 to microalgae Pseudokimhnenella subcapitata[J].Science of the Total Environment，2009，407（4）：1461-1468.

[17]辛元元，陳金媛，程艷紅，等.納米TiO2與重金屬Cd對銅綠微囊藻生物效應的影響[J].生態毒理學報，2013，8（8）：23-28.

[18]鮮啓鳴，陳海東，鄒惠仙，等.沉水植物中揮發性物質對銅綠微囊藻的化感作用[J].生態學報，2006，26（11）：3849-3854.

[19]陳愛葵，韓瑞宏，李東洋，等.植物葉片相對電導率測定方法比較研究[J].廣東教育學院學報，2010，30（5）：88-91.

[20]丁惠君，彭祺，張維昊，等.三種濕生植物對微囊藻的化感作用初步分析[J].環境科學與技術，2007，30（4）：7-10.

[21]呂卓，謝冰，徐亞同.青草沙水源地水庫藻類監測預警指標體系研究[J].環境科學與技術，2011，34（10）：118-122.

[22]張剛，王兆菡，張立卿.停留時間對富含藻類水廠排泥水污泥調質的影響[J].濟南大學學報，2005，19（2）：159-162.

[23]萬方浩，郭建英，王德輝.中國外來入侵生物的危害與管理對策[J].生物多樣性，2002，10（1）：119-125.

[24]廖周瑜，趙則海，侯玉平，等.五爪金龍對薇甘菊的化感效應研究[J].生態環境，2007，16（3）：939-943.

[25]張維昊，周連鳳，吳小剛，等.菖蒲對銅綠微囊藻的化感作用[J].中國環境科學，2006，26（3）：355-358.

[26]須海麗，楊宇，耿廣東.空心蓮子草浸提液對3種蔬菜種子萌發的化感效應[J].山地農業生物學報，2008，27（6）：547-549.

（責編：張宏民）