藥用菊花組織培養技術研究進展

趙維萍 王艷琪 劉洋

摘? 要：該文分析了藥菊組織培養過程中存在的問題，歸納總結了藥菊的病毒檢測及脫毒方法、外植體的選擇和處理以及組織培養過程中各個階段的優良培養基的選擇和培養的條件。

關鍵詞：藥菊;病毒檢測;脫毒;階段培養

中圖分類號 S682.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0036-4

Abstract：Based on the analysis of the problems in tissue culture in recent years，the methods of virus detection and detoxification，the selection and treatment of explants，and the selection and culture conditions of fine culture medium in each stage of tissue culture were summarized.

Key words：Medicinal Chrysanthemum;Virus detection;virus-free;Stage culture

滁菊、貢菊、杭菊、亳菊共稱為中國4大藥菊[1]，《中藥志》與《中華本草》中稱滁菊和亳菊的品質最優。藥菊的主要有效成分有黃酮、氨基酸、揮發油和絹云母、麥飯石等礦物質，以及鋅、硒等多種微量元素，具有清熱解毒、護膽明目、舒筋活血、解瘡毒以及增強免疫力的功效?，F代藥理學研究認為，藥用菊花具有改善心血管功能、抗癌、抗菌、擴血管、抗氧化等作用，是藥用和飲料兼用的優良中藥材[2-7]。

1 藥菊組織培養的意義及存在的問題

藥菊的繁殖方式主要有分株、插條等，這類方法便于推廣、且成本低。但在長期的生產中，由于連作、病害累積及復合侵染等因素，造成菊花花朵偏小、生長勢減弱、抗逆性變差、葉上會出現明顯斑點等問題，使菊花的品質和經濟價值大大降低，從而影響了藥菊產業的健康發展[8，9]。在自然條件下，病毒一旦侵入到植物體內，就很難根除，要想有效地實現藥菊的脫毒和復壯，植物組織培養是一個非常好的手段。

植物組織培養是20世紀發展起來的一項新技術，近30年來發展極為迅速[10]，其技術的優點在于：培養條件可控，在室內培養，不受外界多變的環境影響。選用組培脫毒苗進行栽培，不僅可以增強藥菊的適應能力和抗逆能力，提高品質，而且減少了農藥在栽培過程中的使用量。藥菊的組織培養，對于生態環境的保護和藥菊的可持續發展具有非常重要的意義[11]。

目前，藥菊組織培養技術雖已經已有了很大的提高，但培養過程中仍存在內生菌、褐變和試管苗玻璃化等現象，以及優良品種生根困難等問題。因此，不同品種的藥菊組織培養仍需進一步探討[12，13]。

2 藥菊的病毒檢測及脫毒方法

病毒檢測是運用一些簡單可靠的技術方法來判斷植物病害是由哪種病毒引發的。植物的病毒檢測在傳統檢測方法的基礎上已經得到了完善，檢測速度及準確性也大幅提高。目前，菊花病毒的檢測技術主要有生物學檢測、電子顯微鏡檢測、分子生物學檢測及血清學檢測等[9，14]。藥菊脫毒的方法主要有：莖尖組織培養脫毒法、熱處理結合莖尖組織培養脫毒法、化學處理脫毒法、超低溫結合莖尖組織培養脫毒法[9]。

3 藥菊組織培養的原理

植物組織培養是指在無菌的條件下，將離體的器官、組織（細胞、胚胎、原生質體等）接種在人工配置的培養基上，并設定適宜的環境條件，經過脫分化形成愈傷組織、再分化培育成1株完整的植株[10]。進行藥菊的組織培養時，外植體一般都選取生長良好、無病蟲害的植株。根據組織培養的植物細胞全能性的原理，菊花的任何部位都可以作為植物組織培養的外植體材料，但是菊花的不同部位的分化能力有所不同，所以在組織培養時應該根據具體情況選擇合適的外植體。周瑞玲等用菊花的莖尖、莖段和側芽作為外植體進行對比試驗，在后續研究菊花的組織培養過程中發現以莖尖外植體最好[15]。梁稱福等用菊花的嫩莖段作為材料建立無菌體系，再進行誘導芽分化、生根等試驗，探討了菊花組織培養快繁的技術[16]。齊向英等以菊花當年生莖段為材料，進行初代培養[17]。劉鵬等以菊花莖尖作為外植體進行脫毒培養[18]。司懷軍等利用‘熬霜幼嫩花瓣為外植體材料[19]。劉興玉等以菊花花瓣為外植體進行組培快繁并取得成功[20]。符運柳等分別以菊花腦的頂芽和腋芽為外植體進行組培研究[21]，經多年的研究表明，采用藥菊莖尖分生組織建立無菌體系最好，并且取莖尖分生組織頂端處圓錐區內的長度不超過0.1mm，但實際操作非常困難且不易成活，目前藥菊組織培養所取的莖尖均超過了0.1mm。

4 藥菊組織培養技術研究進展

4.1 外植體的處理 外植體的處理非常重要，若消毒劑使用不恰當或者處理時間不當，內源菌未徹底處理，后期會影響外植體的生長發育。外植體剛從野外采摘回來時應先用流水清洗干凈，如果表面污垢比較多，可以適當的使用洗衣粉等。不同的外植體在使用消毒劑時的處理時有一定的差異，顧昌華等對菊花外植體的消毒處理，分別使用了7種不同消毒劑進行處理，研究不同消毒劑的消毒效果，結果表明，菊花的外植體頂芽用2%次氯酸鈉+0.1%升汞消毒各5min，側芽以0.1%升汞消毒5min后效果最佳[22]。經過消毒劑處理過的外植體，再用無菌水沖洗5～6次即可[23]。

4.2 環境條件 藥菊在培養基含量為1/4MS～2MS的條件下，其苗高、葉面面積、葉綠素含量、鮮重、干重均呈現出隨著培養基含量的增加而升高的趨勢;不添加蔗糖，藥菊組培苗將停止生長甚至死亡，當蔗糖濃度在1.5%～4.5%時，其苗高、葉面面積、葉綠素含量、鮮重、干重均呈現出隨蔗糖濃度的增加而升高的趨勢，但藥菊的增殖系數卻表現為先增后降的趨勢。由此認為，培養的最佳條件為MS+蔗糖3%[24]。瓊脂是培養基中的固化劑，適量的瓊脂有利于藥菊植株的生長，隨著瓊脂濃度的增加，其膠凝粘聚性、硬度、彈性也增加，瓊脂含量過高時，培養基的硬度過大，其透氣性降低，從而導致藥菊植株吸收營養物質困難，根系形成也將受到影響。因此，適宜的培養基瓊脂含量對藥菊組織培養具有重要的意義。MS培養基中一般添加0.7%～0.8%的瓊脂，再加入不同種類和濃度配比的植物生長調節劑進行不定芽的誘導、增殖和生根培養。在植物組織培養過程中，不同的植物或品種需要的培養環境及條件也有很大差異。對于藥菊的組織培養而言，不同的溫度、濕度、光照強度、酸堿度、培養時間等都會影響到外植體的脫分化和再分化，從而影響后期誘導不定芽的數量、擴繁的速度、植株根的數量以及葉片中葉綠素含量等。較弱的光照有利于藥菊愈傷組織不定芽的誘導、增殖和植株生長、根數的增多，較強的光照有利于芽的生長、葉片的發生和根的伸長，過強的光照會造成芽色變白和苗色變淡。研究表明，藥菊組織培養的光照強度一般為2000～3000lx，光照培養時間為12h/d，黑暗培養時間為12h/d，適宜的溫度為（25±1）℃。相對濕度也是影響組培苗生長發育的重要因素，相對濕度過高，容易引起培養物的污染和玻璃化等問題，還會改變試管苗的葉片結構，降低蒸騰拉力，嚴重影響其正常生長，一般認為，80%左右的相對濕度較適合組培苗的生長。另外，培養基酸堿度也能影響外植體對培養基中營養的吸收，不適宜的pH可能會導致組培植株的褐變或玻璃化等[23，25]。從藥菊的組織培養研究進展可知，組培苗的適宜培養基的pH在5.8～6.0。

在藥菊植物組織的培養過程中，培養基中添加適量的活性炭，可提高培養體內可溶性蛋白和總糖的含量，模擬和自然環境土壤類似的黑暗環境，并且可以吸附組培植株在生長過程中分泌的物質和容器中某些氣體成分來減少不利因素對植株的影響，防止褐化和促進生根的作用[26]。

4.3 階段式培養

4.3.1 初代培養 藥菊以MS作為初代培養的基本培養基，外加適量6-BA、NAA、KT或TDZ等生長調節劑。在組織培養過程中，培養基中的細胞分裂素、生長素等有一定比例，一般來說，較高濃度的細胞分裂素有利于形成不定芽，較高濃度的生長素有利于形成根;當細胞分裂素和生長素處于一定平衡的濃度時，有利于形成愈傷組織[27]。鄧衍明等在研究滁菊脫毒苗時，采用改良的熱處理結合植株莖尖分生組織培養的方法，建立了滁菊組織培養脫毒苗快繁技術體系，得出滁菊莖段誘導愈傷組織的最佳培養基為MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA;滁菊的莖尖增殖的最佳培養基為MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA[14]。王康才等在研究杭菊時，用杭菊露白期的花瓣作外植體進行研究，得到最佳的誘導愈傷組織培養基為MS+0.2mg/L NAA+2mg/L KT[28]。鄧年芳等以菊花的花瓣作為外植體進行組培快繁技術的研究，得出誘導菊花愈傷組織的最佳培養基為MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA[29]。薛建平等以藥菊的葉片作為外植體，用背接的方式接于MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA誘導植株再生效果最好[23]。蔣細旺等以菊花為試材，分別以莖段和葉片作為外植體，研究不同的植物激素對離體培養的植株生長的影響，實驗表明杭白菊最佳的生根培養基為1/2MS+0.1～0.2mg/L NAA[30]。候玉杰等以菊花側芽莖尖作為外植體進行組織培養實驗，得出菊花莖尖離體培養的適宜培養基為MS+5.0mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA[31]。孫景欣用菊花切花“黃秀鳳”的莖尖作為外植體，得到誘導愈傷組織最佳的培養基為MS+0.2～1mg/L NAA，叢生芽長勢強[32]。誘導芽分化并不一定需要加入植物激素，符運柳等分別以菊花腦的頂芽和腋芽為外植體進行組培研究，結果表明，在不添加任何激素的MS培養基中培養5d，就能誘導出不定芽[21]。湯雪燕以菊花花托作為外植體，在MS培養基中加入6-BA 0.4mg/L十TDZ 2.0mg/L+ NAA0.3 mg/L時，形成愈傷組織多，愈傷組織結實，芽誘導效果最好[33]。李卓姣用菱葉菊幼嫩莖尖為材料進行組培繁殖研究，得出菱葉菊最適不定芽誘導培養基為MS+6-BA 3mg/L+NAA 1mg/L[34]。從以上研究結果可以得出：誘導菊花愈傷組織的最適宜的培養基為MS+6-BA 0.4mg/L+TDZ 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L。

4.3.2 繼代培養 藥菊繼代培養是組培擴繁獲得大量無根苗的重要方法。一般有以下2種途徑，一是將愈傷組織上的從芽分離，將分離的藥菊愈傷組織塊接種在培養基上培養，分化成更多的芽;二是將長成的無根試管苗切成帶葉或帶芽的小段，接種于培養基上，然后長成幼苗[35]。候玉杰在MS基礎培養基上附加3.0mg/L 6-BA和0.01mg/LNAA進行菊花繼代培養時，芽苗長勢較旺，適宜作為菊花繼代培養擴大繁殖的培養基[31]。符運柳等分別以菊花腦的頂芽和腋芽作為組織培養的外植體進行研究，認為適宜菊花的增殖培養基為1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA[21]。經研究者的重復實驗和各個實驗結果對比可知，藥菊組織培養快速繁殖的最適培養基為MS+3.0mg/L 6-BA+0.01mg/LNAA。

4.3.3 生根培養 鄧衍明等在研究滁菊脫毒苗時，表明滁菊生根培養最佳的培養基為1/2MS+0.1mg/L NAA[14]。黃丹楓等通過實驗得出誘導滁菊組培苗生根的適宜培養基是1/2MS+0.2mg/L IBA[36]。符運柳等認為適合誘導藥菊生根的培養基為1/2MS+0.1mg/L NAA[21]。袁成志等認為誘導生根的最佳培養基1/2MS+NAA 0.1mg/L[37]。劉金等認為在1/2MS+1mg/LIAA或1/2MS+0.2mg/L NAA培養基最有利于生根[18]。鄧年芳等用1/2MS+0.5mg/L NAA作生根培養基，生根率可達100%[29]，能夠穩定地生根是煉苗移栽的必要條件。從以上綜述的各個生根培養的實驗結果來看，1/2MS+0.5mg/L NAA作為生根培養基的效果最佳。

4.4 煉苗與移栽基質 由于藥菊組培苗從接種到長成完整的植株一直是在比較適宜并且可控的室內環境下，當組培苗從組培瓶中移出后，其生長環境必然發生很大變化，自然環境會影響到幼苗的成活率。所以移栽前需要先進行煉苗，煉苗方法如下：生根的組培苗長到苗高約3cm左右，白根露出，有側根時可以進行煉苗。朱濤等研究表明，3d為煉苗合適的時間，此時幼苗的成活率最高，可達95%以上，少于或多于這一時間，都會引起成活率下降，如果煉苗時間過短，幼苗將不能很好地適應環境變化;煉苗時間過長，則幼苗榮易感染細菌病毒[30]。經過煉苗后，將組培苗取出，用清水小心洗去根部殘留培養基，用多菌靈或百菌清洗液殺菌1～2min，然后移栽到基質中。煉苗基質一般有2種：一種是泥沙土與腐質土，另一種是石+珍珠巖+腐質秸稈[1]，也有的移栽基質采用泥炭與椰糖各半的混合基質[38]?？傊?，煉苗時保證組培苗能夠適應外界環境是關鍵，移栽時選擇透氣性好，保水性能高的基質。

5 結語

藥菊作為藥用草本植物，其藥用價值不容小覷，醫藥業對于藥菊的需求不斷地增多，但是各種藥菊的地域性都很強，對于生長環境的要求也非常高。就目前而言，藥菊的生產仍屬于小規模生產，并沒有實現工廠化和自動化生產，如何利用有效的地域來獲得更多品質優良的菊藥，是人們關注的問題。藥菊在長期的栽培過程中出現了各種問題，導致產量并不理想，因此，研究藥菊的脫毒苗的組織培養技術十分必要。近年來，藥菊組織培養雖取得了較大的進步，但是藥菊的脫毒手段、病毒檢測以及各個階段的組織培養等都還有很大的空間進步，需要今后不斷地研究探索。

參考文獻

[1]王霏.毫菊資源與種苗繁育及品質分析的研究[D].合肥：安徽農業大學，2013.

[2]王珊，李友連，蘇靖，等.中國藥用菊花品種及加工方法變遷的研究[J].中國藥學雜志，2017（7）：539-542.

[3]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：科技技術出版社，1999.

[4]滁菊組織培養脫病毒技術與脫毒苗的應用研究[D].武漢：華中農業大學，2006.

[5]代麗萍，胡蕙露，丁元春，等.藥菊組織培養研究進展[J].安徽農學通報，2008，14（7）：86-88.

[6]Sang C J，Sang M K，Yong T J，et al.Hepatoprotective effect of water extract from Chrysanthemum indicum L.flower[J].Chinese Medicine，2013，8（1）：7.

[7]孫向玨，沈漢明，朱心強.菊花提取物抗腫瘤作用的研究進展[J].中草藥，2008，39（1）：148-151.

[8]龔建國，楊雪，李婷，等.利用葉片再生進行滁菊組培擴繁[J].安徽農業科學，2013，415（18）：7788-7789.

[9]菊花病毒鑒定及莖尖培養脫毒方法研究[D].南京：南京農業大學，2012.

[10]甜葉菊同源四倍體種質創新及生物學特性比較[D].南京：南京農業大學，2013.

[11]張家瑛.貢菊離體快繁體系優化及種苗分級標準研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2016.

[12]李辛雷，陳發棣，王紅，等.菊花外植體再生體系的研究[J].上海農業學報，2004（2）：13-16.

[13]王麗華，王永清，陳文德，等.菊花組織培養技術體系研究[J].安徽農業科學，2005（8）：1416-1417.

[14]鄧衍明，褚芳玲，華如枝.滁菊組織培養脫病毒技術研究[J].安徽農業科學，2007（14）.

[15]周瑞玲，吳雨龍.菊花的組織培養及移栽技術初探[J].江蘇林業科技，2001（2）：23-24.

[16]梁稱福，易誠，范適，等.菊花組培快繁技術研究[J].湖南環境生物職業技術學院學報，2006（3）：242-244.

[17]齊向英，鄭丹，張超，等.菊花組織培養研究[J].江蘇農業科學，2009（5）：63-64.

[18]劉鵬，劉金，趙艷紅，等.菊花的組織培養、脫毒與快繁技術研究[J].內蒙古民族大學學報：自然科學版，2005（4）：410-413.

[19]司懷軍，戴朝曦，于品華，等.菊花幼嫩花瓣愈傷組織的誘導和植株再生[J].甘肅農業大學學報，1998（2）.

[20]劉興玉，蒲紅.菊花花瓣的組織培養[J].西南農業大學學報，1990（2）.

[21]符運柳，王永壯，郭慶輝，等.菊花腦的組織培養與快速繁殖[J].安徽農業科學，2010（24）：13367-13368.

[22]顧昌華，鄭利鋒.世界名菊——墨菊花的組織培養與快速繁殖技術[J].種子，2006（6）：93-94.

[23]薛建平，張愛民，盛瑋，等.安徽藥菊莖尖組織培養技術的研究[J].中國中藥雜志，2002（5）.

[24]孫翊，費如桂，殷麗青，等.培養基和蔗糖對非洲菊增殖及其生長特性的影響[J].經濟林研究，2017，35（2）：183-187.

[25]香蕉新品種“紅研一號”引種栽培試驗與良種組培快繁研究[D].南寧：廣西大學，2014.

[26]楊振德，朱麟，謝立群，等.百部組織培養中不定根的誘導[J].江西農業大學學報，2003，25（4）：566-570.

[27]葉綠.試談潘瑞熾、董愚得《植物生理學》（上冊）的“架子”[J].植物生理學通訊，1986（1）：54-55.

[28]王康才，張雪瓊，茅毓英.杭菊花花瓣組織培養[J].中草藥，2000（8）.

[29]鄧年方，吳桂容.菊花花瓣的組培快繁技術研究[J].賀州學院學報，2007（3）：144-145.

[30]蔣細旺，劉國鋒，包滿珠.菊花9個品種葉片和莖段快速高效再生體系的建立[J].華中農業大學學報，2003（2）：162-166.

[31]侯玉杰，朱濤，王曉濤.菊花的組織培養研究[J].信陽師范學院學報：自然科學版，2005（3）：323-325.

[32]孫景欣，馮志萍.菊花切花“黃秀鳳”莖尖培養加速繁殖的研究[J].中山大學學報論叢，1992（3）：186-189.

[33]湯雪燕，趙統利，邵小斌，等.TDZ在非洲菊組培快繁中的應用[J].安徽農業科學，2015（30）：31-32.

[34]李卓姣，李麗.菱葉菊組培繁殖研究[J].西南師范大學學報（自然科學版），2017，42（8）：46-50.

[35]劉忠榮.菊花組培快繁[J].中國花卉盆景，2003（8）：36-37.

[36]黃丹楓，汪覺先，毛炎.切花菊新品種的組培快繁試驗[J].上海農業科技，1992（2）：38-39.

[37]袁成志，李波，楊蔚然，等.激素對菊花愈傷組織誘導和叢生芽分化的影響[J].北方園藝，2010（1）：162-164.

[38]陳喜林，陳曉彬，陳琦磊.菊花組培快繁技術在實際生產中的應用[J].福建熱作科技，2009（4）.

（責編：張宏民）