基于“通腎絡、益脾腎”治法研究足細胞凋亡及自噬*

范增慧，馬鋒鋒，李小會，陳麗名，谷浩榮

（陜西中醫藥大學，咸陽 712046）

糖尿病腎?。―N）發病率逐年上升，伴隨病程進展導致的終末期腎衰往往是該病的結局。DN患者無論病情輕重大多存在蛋白尿的臨床癥狀，蛋白尿的產生、發展及腎小球硬化程度與足細胞數目減少和密度降低密切相關。足細胞終末分化的特性決定其損傷丟失后幾乎不可再生，作為腎小球濾過膜的關鍵屏障，高糖導致的足細胞凋亡會直接影響及細胞毛細血管壁的選擇通透性加重腎損傷，因此成為DN發生發展的最主要受累靶細胞。細胞凋亡是足細胞損傷丟失的主要原因，而自噬可能是細胞自體減少凋亡發揮自身保護作用的主要機制。細胞自噬具有雙面調節性，保護性及損傷性作用根據細胞種屬的不同而不同，研究顯示腎臟中足細胞的自噬水平較其他細胞高[1]?；谧允珊图毎蛲龅年P系，進一步探討通絡益腎方能否通過啟動自噬有效降低體外高糖誘導的小鼠腎足細胞（MPC-5）凋亡對腎小球濾過屏障起保護作用，使該方在臨床控制DN病情惡化、減少蛋白尿及腎小球硬化程度的分子水平得到印證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 成熟無特定病原體（SPF），SD雄性大鼠40只（許可證號：SCKK（陜）2017-003，合格編碼：61001700002816），由西安交通大學實驗動物中心提供，體質量180～220 g。

MPC-5小鼠腎足細胞株（編號：BNCC337685，由北納生物科技有限公司提供），增殖結束后置于37℃恒溫，含5%CO2培養箱中孵育，培養基由紅變黃后使用胰蛋白酶消化，按照1∶3傳代，繼續培養至顯微鏡觀察細胞呈長梭形上皮細胞樣，有星形樹枝狀突起，符合文獻報道特征，進行后續實驗。

1.2 實驗藥品、試劑 通絡益腎方由生地、山茱萸、山藥、茯苓、制附子、澤瀉、水蛭、全蝎、桃仁、酒大黃組成，全部藥材經陜西中醫藥大學附屬醫院中藥房提供并鑒定，藥材質量達標。生藥材按照30∶15∶15∶12∶10∶12∶6∶10∶12∶10 比例，分高、中、低（4.76 g/mL、2.38 g/mL、1.19 g/mL）劑量購買所需生藥材。0.9%生理鹽水購買于西安交通大學第一附屬醫院西藥房。

胎牛血清（美國Hyclone公司，SV30087.02）；1640培養基無糖、無HEPES（美國Hyclone公司，11879020）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，AR0146）；沉默信息調節因子1（SIRT1）、B淋巴細胞瘤-2基因/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3（bcl-2/BNIP3）一抗（美國Abcam公司，ab189494、ab109362）；Bcl-2 相關 X 蛋白（Bax）、P62蛋白（P62）一抗（美國CST公司，3498S、23214S）；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，CA1020-100T）；羊抗兔二抗100μL（武漢博士德生物工程有限公司，BA1054）；Hoechst33342（北京索萊寶科技有限公司，C0030）。

1.3 主要儀器 尼康倒置光學顯微鏡（型號：SMZ745，上海普赫生物科技有限公司）；流式細胞儀（型號：FACS Calibur，美國 BD公司）；恒溫細胞培養箱（Forma3111型，美國Thermo公司）；超凈細胞工作臺（型號：SW-CJ-2FD，蘇凈科學器材有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 含藥血清制備 成熟SPF級SD雄性大鼠40只，隨機每組10只分為正常組、通絡益腎方高、中、低劑量組4組。中藥制劑根據人與大鼠體表面積折算系數最終按照4.76、2.38、1.19 g/mL藥物濃度分高、中、低劑量。大鼠連續給藥10 d，每日按2 mL灌胃。正常組取0.9%生理鹽水等劑量灌胃。于末次給藥2 h后，腹主動脈取血，血清過濾分裝后-20℃保存待用。

1.4.2 細胞分組及給藥 將細胞快速復蘇后接種于 9∶1∶0.1（DMEM 培養液∶胎牛血清∶青霉素鏈霉素混合液）比例配制細胞培養液中，37℃、5%CO2培養條件培養，每2～3 d換液1次，待細胞分化成熟，倒置顯微鏡觀察大體呈鵝卵石樣形態，末端有分枝，接種于6孔板中融合至80%～90%，改用含1%胎牛血清培養液使細胞饑餓6～8 h后分6組加藥干預。正常組：5.6 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清；高糖組：30 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清；通絡益腎方高、中、低劑量組：30 mmol/L葡萄糖+10%高、中、低劑量含藥血清組，高滲組：甘露醇24.5 mmol/L+10%正常大鼠血清；細胞干預48 h胰蛋白酶消化收集細胞，進行指標檢測。

1.4.3 Hoechst33342觀察細胞凋亡 細胞按照分組依次種于6孔板，密度達60%～70%，加藥干預。48 h后PBS清洗掉雜質及死細胞，4%多聚甲醛固定液常溫固定15 min，去除固定液后再次清洗。6孔板每孔加入500 μL Hoechst33342熒光染料，室溫反應20 min，封片染色后直接置于熒光顯微下觀察。

1.4.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測足細胞凋亡率 Annexin V/PI雙染可以反應藥物干預后的細胞生長狀態從而區分凋亡早期和晚期細胞，首先用去離子水按照 9∶1 稀釋 Binding Buffer（10×）備用。15 mL離心管先收集細胞上清液加貼壁細胞，混均后800 g離心5 min棄培養基，向上清細胞和貼壁細胞混液中各加入500 μL Binding Buffer重懸，移至同一離心管使細胞密度達到1×106個。1.5 mL EP管中吸入100 μL細胞，先加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，再加入5 μL PI同上反應5 min，反應結束后加入390 μL PBS，混勻后上機檢測。

1.4.5 Western Blot檢測自噬標志蛋白SIRT1、P62及促凋亡蛋白BNIP3、Bax表達 蛋白樣品提取全程冰上操作，清洗并離心收集細胞，放入1.5 mL EP管中加入配制好的RIPA裂解液槍頭反復抽打充分裂解裂解30 min，4℃10 000 g/5 min離心去除氣泡，吸出上清，并計算量。使用BCA法測定蛋白濃度，96孔板設置兩個復孔，依次加入標準品BSA、蛋白樣品、純水。計算出所需BCA工作液的體積配制待用，加入工作液后37℃孵育30 min酶標儀定量，最后加入上樣緩沖液，煮沸后-80℃保存待用。根據蛋白分子量配制相應濃度分離膠、濃度膠，蛋白上樣后80 V/30 min，110 V/90 min電泳，然后快速轉膜，TBST洗膜3遍每次10 min，封閉2 h，孵一抗，4℃過夜。洗膜后孵二抗，置搖床2 h，ECL顯色。利用Image Pro Plus6軟件凝膠成像分析灰度值，并以β-actin為內參計算各蛋白表達強度的變化，分析灰度值結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據統計，計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測足細胞凋亡率 各組細胞凋亡率數據分析以P＜0.05具有統計學意義；與正常組細胞相比，高糖組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），高滲組細胞凋亡率無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與高糖組相比，通絡益腎方中劑量組細胞凋亡率顯著改善，有統計意義（P＜0.01），通絡益腎方低劑量組細胞凋亡率也有所下降（P＜0.05），但改善效果不如中劑量組，通絡益腎方大劑量組細胞凋亡率無明顯改變，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表 1。

圖1 流式細胞儀檢測足細胞凋亡率（%）Fig.1 The apoptosis rate of podocytes detected by flow cytometry（%）

表1 流式細胞儀檢測足細胞凋亡率（x±s）Tab.1 The apoptosis rate of podocytes detected by flow cytometry（x±s）

2.2 Hoechst33342凋亡染色結果 Hoechst33342染色圖片可見正常組和高滲組熒光圖片藍染較淡，細胞均勻橢圓彌散，細胞核基本無強熒光點聚集，高糖組細胞凋亡最多，細胞核呈團塊碎裂，染色質皺縮發出致密或碎塊狀強靛藍光。通絡益腎方中劑量組、低劑量組與高糖組相比凋亡細胞數量有所下降，中劑量方效果最佳，高劑量組因藥物濃度大對細胞有毒性，細胞足突融合導致細胞貼附能力下降，熒光圖片顯示細胞不均勻分布，視野內滿布強熒光團，呈現凋亡細胞典型特征。見圖2。

2.3 足細胞 SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白表達 蛋白印跡結果顯示，與正常組相比，高糖組SIRT1蛋白表達下降，BNIP3、P62、Bax蛋白表達升高（P＜0.05或P＜0.01），差異有統計學意義。與高糖組相比，通絡益腎方中、低劑量組SIRT1蛋白表達升高，BNIP3、P62、Bax蛋白表達下降（P＜0.05或 P＜0.01），說明治療有意義。高劑量組 SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白表達未見明顯改變（P＞0.05），差異無統計學意義。見表2、圖 3。

3 討論

通絡益腎方治療糖尿病腎病是本實驗室近幾年的重點研究課題，中醫理論認為DN是糖尿病遷延日久耗氣傷陰久則病理產物痰、熱、瘀、毒損脾、腎，耗五臟而形成?；贒N動態變化的病機基礎，杜雨茂[2]教授總結多年臨證經驗發現本虛標實，腎虛絡瘀毒蘊貫穿DN始末，針對這種虛實并見的復雜病理特點，立法滋陰溫陽，解毒通絡（通腎絡、益脾腎），治療上選用腎氣丸、抵當湯合方化裁的通絡益腎方治療。全方組方靈活滋陰助陽之中意蘊通絡解毒之效，消補兼施之則適用腎虧陰陽兩虛，毒瘀阻絡證。方中生地、山藥、山茱萸、制附子、澤瀉、茯苓共奏益脾腎之功。腎為水火之臟，《素問》有“腎者主蟄”之說，腎藏精陰陽充沛對其氣化、固攝、封藏職能的正常發揮，有著舉足輕重的作用，生地滋腎陰，制附子助腎陽，陰陽兼顧之中鞏固了腎臟封藏功能；山藥、澤瀉、茯苓補脾兼滲濕，補而不滯；山茱萸一能收斂固澀、二與生地配伍益腎陰，六藥配伍能兼顧先后天，先天的職能得以正常發揮，后天的遺失能迅速回補，減少蛋白尿、水腫癥狀的同時補益了久病虧耗之體。全蝎、水蛭、大黃、桃仁共施泄濁排毒化瘀之功，共祛腎絡實邪。本課題前期研究從臨床觀察、動物及微觀細胞實驗等多角度、全面證實了該方能減輕患者臨床癥狀、延緩腎小球硬化周期及減少尿蛋白，改善DN大鼠腎臟功能、病理及生化指標，分子水平深入探究證實該方還具有對抗內質網應激抑制系膜細胞增殖、凋亡[3-4]、穩定足細胞骨架等作用[5]。前期的研究基礎為本課題的開展奠定了基礎。

圖2 熒光倒置顯微鏡觀察各組足細胞凋亡及形態變化（×200）Fig.2 Apoptosis and morphological changes of foot cells observed by fluorescence inversion microscope（×200）

圖3 各組細胞SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白/內參表達量水平（x±s）Fig.3 Expression levels of SIRT1,BNIP3,P62 and Bax protein in cells of each group（x±s）

糖尿病腎病足細胞黏附能力下降、密度、數量減少和進行性功能喪失是導致腎小球濾過膜通透性改變從而加速蛋白尿發生發展的重要因素[6]，高糖導致的凋亡是其丟失的關鍵。因此保護足細胞抑制其凋亡成為該病防護和治療的切入點。自噬是真核細胞應對復雜生理和營養缺乏、炎癥刺激、氧化應激等病理過程的保護性防御機制，基礎水平的自噬可程序性降解受損細胞器、清理大分子物質及錯誤折疊蛋白質為細胞自我修復、更新提供原料，從而維持細胞穩態。最初研究認為凋亡與自噬是隸屬于程序性細胞死亡下截然不同的兩種細胞死亡方式，分別為Ⅰ型和Ⅱ型[7]。隨著研究的深入發現它們在某些通路上因受共同的蛋白調節而存在密切的聯系。同種病理、生理條件刺下因強度的不同或激發自噬或啟動調亡[8]。DN時足細胞在高糖等因素刺激下，既可通過自噬清除廢棄的蛋白和細胞器，也可出現細胞凋亡，在不同時期，自噬和凋亡的活性可能出現變化。查閱文獻總結兩者的關系為以下幾個方面，位居上游的自噬啟動凋亡并影響凋亡的程度[9]。自噬可通過多途徑維持細胞內環境穩定抑制細胞凋亡[10]。因自噬具有雙重性，兩者可相互轉換，在復雜的細胞內部或協同促進細胞死亡或尋找調控雙方的穩態平衡[11]。黃貴華等[12]從中醫理論闡述自噬，稱其為臟腑功能失調久致機體正虛邪實，機體為維持陰陽平衡狀態的自救方式。因此，深入探究自噬與凋亡關系在調節足細胞的病理生理過程中有著重要的意義。檢測技術及中醫藥事業的的迅猛發展為大家深入研究不同疾病，不同病期綜合防治DN提供了新途徑、新思路[13-14]。

表2 各組足細胞SIRT1、BNIP3、P62和Bax蛋白/內參相對表達量水平（x±s）Tab.2 Relative expression levels of SIRT1，P62，BNIP3 and Bax protein/β-actin reference in podocytes of each group（x±s）

自噬標志蛋白SIRT1、P62能夠啟動自噬恢復高糖培養的腎臟細胞內部能量穩態重建阻止DN發生和發展[15-16]。研究表明其參與DN病理、生理進程，通過多途徑發揮細胞保護作用可成為防治DN的新靶點[17-18]。BNIP3屬于Bcl-2亞家族，與Bax均被稱為促細胞凋亡的中心調控蛋白，在凋亡中的研究比較透徹，近年發現BNIP3不僅影響凋亡還能激活線粒體自噬[19]。本實驗研究發現正常組足細胞中自噬標志蛋白SIRT1的表達量較高，而在高糖刺激下的足細胞內表達降低，通絡益腎方含藥血清中、低劑量干預組細胞內SIRT1的蛋白表達量較高糖組增高，說明該方可誘導高糖刺激下的足細胞自噬，提高自噬水平，保護細胞。而BNIP3、P62和Bax蛋白在正常組足細胞中的蛋白表達變化與SIRT1完全相反表達低，高糖刺激下的足細胞內表達升高，利用中藥中、低劑量含藥血清干預后，細胞內促凋亡蛋白BNIP3、Bax和P62蛋白表達量較高糖組降低。而后又利用流式細胞儀及熒光染色對各組足細胞凋亡檢測發現，中藥含藥血清中、低劑量干預組足細胞凋亡率較高糖組有所改善，說明通絡益腎方中、低劑量含藥血清對高糖刺激的足細胞有保護作用，且小劑量組效果不及中劑量組，印證了該方中醫治療DN的有效性及發揮作用的機制。該實驗中Western blot結果顯示 BNIP3/β-actin 和 Bax/β-actin在高糖組細胞中表達量為（0.64±0.04）和（1.29±0.03），在高劑量組為（0.65±0.04）、（1.33±0.11），與高糖組相比，統計分析后發現促凋亡蛋白在高劑量組中表達未下降，自噬標志蛋白SIRT1、P62變化也不具統計學意義。流式細胞儀結果顯示高糖組足細胞凋亡率為19.03%，高劑量組為18.55%，高劑量含藥血清對高糖培養的足細胞凋亡率未能改善。結果證實高劑量含藥血清不能通過改變自噬降低足細胞凋亡率，保護足細胞，延緩死亡。

目前的研究僅證明通絡益腎方能夠調節足細胞自噬、凋亡的代表性蛋白，升高或降低其表達，保護高糖培養的足細胞，減少其凋亡率，但并不能在分子機制上確切證實其因果關系。高劑量組含藥血清對足細胞凋亡率未改善，與高糖組相比不能升高或降低自噬標志蛋白SIRT1、P62及促凋亡蛋白BNIP3、Bax表達，可能與該方中解毒通絡藥物桃仁、酒大黃、水蛭、全蝎的使用有關，后期將對該方進行拆解，探究是否與解毒通絡藥物的使用有關。后續將對本課題進行更加深入的研究，基于自噬的某一條經典通路，利用基因敲除技術，敲除或降低自噬關鍵蛋白或因子，探討通絡益腎方是否仍能保護足細胞，降低凋亡率。并將該方與西藥組作對比，比較治療效果，進一步為DN的中醫診療提供依據，明確通絡益腎方治療DN的確切機制。