大豆蛋白及其水解物的界面流變學行為和攪打性質

張曉敏,何志勇,2,曾茂茂,秦 昉,陳 潔,2,*

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品安全國際合作聯合實驗室,江蘇無錫 214122)

大豆廣泛生長在世界各地,大豆的蛋白質含量很高,約占大豆總含量35%～40%。大豆蛋白含有人體所需的各種氨基酸,比例合理,營養價值高,是最具發展潛力的植物蛋白[1]。大豆蛋白不僅在營養方面有很多優點,在功能性質上也有出色的表現。大豆蛋白的凝膠性可以用于肉類、豆腐等食品的制作,乳化性可以用于咖啡伴侶中,而起泡性則是制作蛋糕、充氣糖果和冰淇淋等泡沫體系食品的重要功能性質。但是天然的大豆蛋白起泡能力和泡沫穩定性并不是特別理想,不能滿足實際應用的需要。目前常用物理改性[2]、化學改性[3]、酶法改性[4]等方法改善大豆蛋白的起泡能力和泡沫穩定性。

泡沫和乳液等食品分散體系的形成和穩定性與蛋白質在界面處的吸附和其它動態界面行為(例如膜粘彈性)息息相關。目前,常用界面流變學技術研究界面處蛋白質的吸附形成過程以及吸附層中分子間的相互作用[5]。7S是大豆蛋白中的一個重要組分,其乳化性和起泡性明顯優于11S。胃蛋白酶選擇性水解可以保留大豆蛋白的7S組分,水解11S組分。本實驗室前期發現大豆蛋白經選擇性水解11S后的產物，其乳化性卓越,可以媲美酪蛋白酸鈉[6]。但是其起泡性的研究并沒有進行,所以在此基礎上,本文使用配備有Du Noüy環的旋轉流變儀研究大豆分離蛋白(SPI)、β-伴大豆球蛋白(7S)、大豆蛋白選擇性水解物(SPSH)及大豆蛋白限制性水解物(SPLH)在空氣-水界面處的吸附層界面剪切流變行為和攪打性質,并與蛋清蛋白(EW)作對比。通過界面剪切流變學獲得大豆蛋白的空氣-水界面性質,分析不同結構對大豆蛋白界面剪切流變學行為和攪打性質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆(臺灣292)、雞蛋 無錫歐尚超市;木瓜蛋白酶(>2000 U/mg) 生工生物工程(上海)股份有限公司;胃蛋白酶(3000～3500 U/mg) 上海斯信生物科技有限公司;低分子量標準蛋白質(14.4～97.4 kDa) 上海升正生物技術有限公司;正己烷、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、鹽酸、氫氧化鈉、無水亞硫酸氫鈉、氯化鈉等 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

JZ7114型粉碎機 上海朝陽微電機廠;Avanti J-26XP高速離心機 美國Beckman公司;GL-10MD大容量高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;LGJ-25C冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;HAAKE MARS Ⅲ流變儀 德國Thermo Scientific公司;Mini-PROTEAN3Cell凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司;DDQ-A40A1型電動打蛋器 小熊電器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆蛋白及其水解產物和蛋清蛋白的制備 按照Diftis等[7]的方法制備大豆分離蛋白(SPI)。將大豆去皮、粉碎,用正己烷∶無水乙醇=10∶1 (v/v)脫脂2 h,料液比1∶3 (w/v),使用真空循環水泵抽提,在通風廚內風干過夜,得到脫脂豆粉。脫脂豆粉加10倍(w/v)的水,用2 mol/L NaOH調節pH至8.0,室溫攪拌2 h,離心(6500 r/min,20 min),取上清,將上清液用2 mol/L HCl調至pH至4.5,靜置30 min,離心(3750 r/min,10 min),取沉淀,將沉淀加水復溶,調節pH至7.0,冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱備用。

根據Ruíz-Henestrosa等[8]的方法稍作修改制備β-伴大豆球蛋白(7S)。將大豆去皮、粉碎、脫脂,脫脂豆粉加15倍(w/v)的水,用2 mol/L NaOH調節pH至7.5,室溫攪拌2 h,離心(6500 r/min,20 min)。在上清液中加入0.98 g/L亞硫酸氫鈉,用2 mol/L HCl調節pH至6.4,4 ℃靜置過夜。離心(6500 r/min,20 min),在上清液中加入0.25 mol/L NaCl,用2 mol/L HCl調節pH至5.0,4 ℃攪拌1 h,再次離心(6500 r/min,20 min)。上清液加1倍(v/v)的水稀釋,用2 mol/L HCl調節pH至4.8,攪拌1 h,離心(6500 r/min,20 min)。沉淀用去離子水清洗3遍,加水復溶,調節pH至7.0,冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱備用。

大豆蛋白選擇性水解產物(SPSH)由大豆蛋白分離物制備,根據Li等[6]的方法稍作修改。將7%(w/v)SPI溶液在55 ℃變性30 min,用2 mol/L HCl調節pH至2.0。將SPI溶液在37 ℃下用胃蛋白酶(E/S=1%)水解3 h。酶反應完成后,立即用2 mol/L NaOH將混合物調節pH至7.0,進行巴氏殺菌。離心(6500 r/min,20 min)后,將上清液冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱備用。

大豆蛋白限制性水解產物(SPLH)由大豆蛋白分離物制備,根據Li等[6]的方法稍作修改。將5%(w/v)SPI溶液調節pH至7.0,在50 ℃的條件下加入木瓜蛋白酶(E/S=0.2%)水解至pH-stat法測得水解度為1.0%時停止水解。水解結束后將水解產物在沸水中加熱10 min,并在冰水中冷卻至室溫。離心(6500 r/min,20 min)后,將上清液冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱備用。

用分蛋器分開蛋清和蛋黃,蛋清液除去系帶,在較低轉速下攪拌均勻,制備蛋清蛋白(EW)。

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) SDS-PAGE在4%濃縮膠和12%分離膠下進行。使用pH8.0的緩沖液,緩沖液中含有0.01 mol/L Tris-HCl,2% SDS,10%甘油和0.02%溴酚藍。將濃度為0.2%(w/v)的SPI、7S、SPSH、SPLH和EW分別與等體積的緩沖液混合,在沸水中加熱3 min,然后冷卻。將試樣(20 μL)上樣到凝膠上。將樣品用考馬斯亮藍R-250染色1 h,并用脫色液(甲醇∶乙酸∶水=2∶3∶35)脫色,直至背景褪色。

1.2.3 界面剪切流變學測量 根據Li等[6]的方法,使用配備有鉑/銥(Pt/Ir)Du Noüy環的HAAKE MARS III流變儀測量待測樣品在空氣-水界面處的界面流變學。使用的Du Noüy環的直徑為19.450 mm,厚度為0.379 mm。將20 mL濃度為0.5%(w/v)的SPI、7S、SPSH、SPLH和EW溶液分別置于燒杯(直徑38 mm)中,將Du Noüy環降低至與溶液表面剛好接觸。在開始每一系列測量之前執行慣量校準和MSC(微應力控制)校準以優化測量結果。

先進行第一次動態時間掃描,以γ=1%的應變振幅(在線性區域中)和ω=1 rad/s的角頻率掃描1 h,記錄彈性模量(G′)、粘性模量(G″)和復數粘度(η)隨時間的變化。之后在ω=1 rad/s下,在γ=0.01%～100%的范圍內進行動態應變掃描,記錄彈性模量(G′)隨應變振幅的變化。最后,進行第二次動態時間掃描,參數和第一次動態時間掃描一致,以觀察應變掃描后的結構恢復,記錄復數粘度(η)隨時間的變化。所有測量均在室溫下進行。

1.2.4 攪打起泡性測定 根據Li等[9]的攪打方法測量泡沫膨脹率(FE)和泡沫穩定性(FS)。將50 mL濃度為16%(w/v)的SPI、7S、SPSH、SPLH和EW溶液分別轉移至500 mL塑料量筒中,然后用電動打蛋器以最高檔攪打10 min。泡沫膨脹率(FE)和泡沫穩定性(FS)計算如下:

其中:V0是液體的初始體積;V1是泡沫的體積;V2是靜置30 min后的泡沫體積。

1.3 數據統計

本文數據均進行三次重復;顯著性差異使用Statistix 9.0軟件進行統計;圖片使用Origin 8.5軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 大豆蛋白及其水解物的SDS-PAGE

圖1顯示了SPI、7S、大豆蛋白選擇性水解產物(SPSH)、大豆蛋白限制性水解物(SPLH)和蛋清蛋白(EW)的SDS-PAGE圖譜。大豆分離蛋白(SPI)主要由7S和11S組成。7S是由α′(71 kDa),α(67 kDa)和β(50 kDa)三個亞基組成的糖蛋白,通過非共價鍵結合。從SDS-PAGE圖譜中可以看出,自提的7S純度不是特別高,還存在部分11S組分。11S由酸性亞基A(約35 kDa)和堿性亞基B(約20 kDa)組成,兩個亞基通過二硫鍵形成穩定的AB亞基。SPI經胃蛋白酶水解得到的SPSH,11S亞基帶消失,7S的三個亞基仍然存在,實現了大豆蛋白的選擇性水解。SPI經木瓜蛋白酶水解得到的SPLH控制了水解度至1%,僅留下分子量約10 kDa的多肽鏈,幾乎沒有二級結構。蛋清中蛋白質種類很多,從SDS-PAGE中可以看出三個比較明顯的條帶。EW在35～45 kDa有一個很寬的條帶,主要是卵白蛋白、卵球蛋白G2和卵球蛋白G3,70 kDa左右的條帶為卵轉鐵蛋白,而10 kDa左右的條帶為溶菌酶。

圖1 大豆蛋白及其水解物的SDS-PAGE圖譜

2.2 大豆蛋白及其水解物的界面剪切流變學行為

2.2.1 蛋白質吸附過程中的模量變化 泡沫的形成和穩定很大程度上取決于蛋白質在界面的吸附、展開、重排以及它們的相互作用。時間掃描實驗可以監測界面處蛋白質的動態吸附過程[6]。圖2顯示了第一次時間掃描空氣-水界面處蛋白質層的界面彈性模量(G′)和粘性模量(G″)隨時間的變化。

圖2 蛋白質的彈性模量(G′)和粘性模量(G″)隨時間的變化

從吸附開始,SPI和7S的彈性模量G′總是大于粘性模量G″,表明SPI和7S在空氣-水界面處的界面膜一直是以彈性為主導的。而SPSH和SPLH,最初G″大于G′,但G″的增長速率較慢,G′迅速增加,增長幅度大于G″,并持續一段時間,在那之后,G′超過G″。不同結構的蛋白在界面吸附時的表現不同,SPI和7S為球狀蛋白質,吸附至界面展開所需的能量較大,所以吸附速度較慢,而經過酶解的SPSH和SPLH分子量降低,多肽的結構更加靈活,所以開始時的G′比較小,但是可以快速地吸附至界面上,迅速增加粘彈性模量。Baldursdottir等[10]指出,球狀蛋白質會在界面處展開和結構重排。G′和G″的增加有可能是界面處的蛋白質分子通過疏水相互作用建立網絡結構[11],也可能是多層吸附結構的形成。球狀蛋白質在界面處的相互作用更強,導致形成的界面膜粘彈性高于SPLH,而SPSH同時存在7S組分和多肽,既可以快速地吸附至界面,同時形成粘彈性強的界面膜。蛋清蛋白(EW)的G′和G″比SPI,7S,SPSH和SPLH大一個數量級,并且G′總是大于G″,表明由EW形成的界面膜在吸附過程中主要表現出彈性,粘彈性很強。隨著吸附時間的增加,EW的G′和G″迅速增加,達到穩定,表明EW在吸附到界面后迅速產生結構重排,達到吸附平衡。EW具有較大的粘彈性模量和較快的吸附平衡,表明EW可以快速在空氣-水界面形成強粘彈性界面膜,防止氣泡積聚,從而保持泡沫的高穩定性。

2.2.2 吸附層結構斷裂情況 為了研究蛋白質吸附層可能的結構斷裂機理,進行了應變掃描實驗。圖3展示了不同蛋白質在空氣-水界面處的彈性模量(G′)隨應變的變化。

圖3 蛋白質的彈性模量(G′)隨應變振幅的變化

SPI和7S在空氣-水界面處的吸附層表現出幾乎相同的斷裂機制。SPI的彈性模量略大于7S的彈性模量,差別不大,均約為10 mN/m。SPI和7S的線性粘彈性區域幾乎沒有顯著差異,均約9%的應變幅度。曾有報道稱大豆蛋白在空氣-水界面處的線性粘彈性區的應變幅度小于0.2%[12]。SPSH的彈性模量大于SPI和7S,約為20 mN/m,表明一些小分子肽可以增加界面的粘彈性,但SPSH的線性粘彈性區小于SPI和7S,約6%的應變幅度。SPSH可以通過形成堅固的高粘彈性界面膜維持泡沫穩定性。雖然SPLH的彈性模量小于SPI和7S,但線性粘彈性區域大,超過10%,表明SPLH具有很強的抗變形能力,這可能是SPLH形成的泡沫穩定性高的原因。通常,線性粘彈性區域越長,凝膠結構越緊密,系統越穩定。EW具有約50 mN/m的彈性模量,顯著高于SPI,7S,SPSH和SPLH,表明由EW形成的空氣-水界面膜具有很強的機械強度。因此,蛋清蛋白在劇烈機械攪打后可形成長期穩定且大量的泡沫。

2.2.3 吸附層結構恢復能力 在應變掃描后快速進行第二次時間掃描,并且通過比較第一次和第二次時間掃描的復數粘度的變化來檢測界面膜結構破壞后的恢復,結果如圖4所示。復數粘度η是彈性模量和粘性模量的綜合反映,可用于描述界面膜的總粘彈性變化。

圖4 蛋白質的復數粘度(η)隨時間的變化

SPI,7S,SPSH,SPLH和EW的第二次吸附的復數粘度恢復非?？?并且最終的復數粘度都可以恢復到第一次吸附時的原始值。除EW外,其他四種蛋白質在時間掃描的60 min內無法達到吸附平衡。SPSH達到平衡所需的時間最長,其次是SPI和7S,SPLH最短?？赡芤驗镾PLH主要含有低分子量肽,幾乎沒有二級結構,所以達到吸附平衡時間最短。SPI和7S的分子量大,界面處的結構重排復雜,而SPSH含有大分子量7S和小分子量肽,蛋白和多肽相互競爭吸附,需要更多能量才能部分擴展到界面上,并且吸附在界面也是最復雜的。通常,更快的吸附速率表示更快地覆蓋空氣-水界面,有助于防止泡沫形成期間的聚集并促進更小氣泡的形成。

2.3 大豆蛋白及其水解物的攪打起泡性質

泡沫的形成取決于空氣-水界面處蛋白質分子的遷移,解析和重排。通過攪打法測量不同蛋白質的泡沫膨脹率(FE)和泡沫穩定性(FS)如圖5所示。蛋白質的起泡性質基本上與它們在空氣-水界面的吸附及其形成薄膜的性質有關[13]。對于SPI,泡沫膨脹率(FE)為450%,泡沫穩定性(FS)是88.89%。7S的FE為400%,7S的FS為87.5%。從界面剪切流變學也可以看出SPI和7S在空氣-水界面的吸附速率很慢,導致SPI和7S的FE比較小。SPI和7S在空氣-水界面形成的界面膜最終G′分別為10.73 mN/m和8.766 mN/m,粘彈性模量較高,這是因為SPI和7S為球狀蛋白,分子間相互作用強,形成了以彈性為主導地位的界面膜,維持了泡沫的穩定性,泡沫穩定性較高。

圖5 通過攪打法測量的不同蛋白質的泡沫膨脹率和泡沫穩定性

與天然大豆蛋白相比,通過酶處理可以大大提高大豆蛋白的起泡性能。酶水解改善了大豆蛋白的起泡性質,其對蛋白質的三種主要結構變化為:平均分子量的降低,疏水區域的打開,以及可電離基團的增加[14]。這些結構變化影響水解產物中肽之間的分子間相互作用,從而影響它們的起泡和界面行為。向日葵分離蛋白的泡沫穩定性也可以通過有限的水解而增加[15]。限制性水解產物SPLH的FE有所提高,為700%,FS為90%。這是因為SPLH主要含有小分子多肽,可以快速地吸附至界面上,迅速增加粘彈性模量,從而提高SPLH的FE。但多肽的相互作用比球蛋白弱,所以SPLH的粘彈性模量比SPI和7S低。SPLH的線性粘彈區很大,超過10%,表明SPLH具有較強的抗變形能力,這可能是SPLH的FS增加的原因。選擇性水解產物SPSH同時含有7S和多肽,多肽可以快速地吸附至界面,球蛋白則可以增加粘彈性模量,所以SPSH的FE也有所提高,為680%,界面膜的粘彈性強度則提供了SPSH穩定的泡沫穩定性。EW的泡沫膨脹率很大,這是因為EW可以在空氣-水界面快速吸附完成結構重排,達到吸附平衡,并且界面膜的彈性模量很大,有很強的機械強度。因此,蛋清蛋白在劇烈機械攪打后可形成大量長期穩定的泡沫。Dabestani等[16]使用糖果混合器攪拌和轉移泡沫至玻璃漏斗稱重的方式計算泡沫膨脹率,測得的數值比本方法低,本方法的操作簡單,并與蛋糕制作的攪打過程類似,可以為將來大豆蛋白在蛋糕應用過程中提供更多參考。

3 結論

本文使用配備有Du Noüy環的旋轉流變儀測定了大豆蛋白及其水解物在空氣-水界面處的吸附層界面剪切流變學行為,并揭示了其與攪打起泡性質之間的關系。不同結構的蛋白質在空氣-水界面表現出不同的界面剪切流變學行為,SPI和7S為球狀蛋白質,吸附速度較慢,SPLH主要含小分子量多肽,可快速吸附至界面上。SPSH同時存在7S和多肽,既可快速吸附至界面,又能形成粘彈性強的界面膜。增加吸附至界面的速度有利于提高泡沫膨脹率。泡沫穩定性與界面膜粘彈性模量大小和線性粘彈性區域大小密切相關,增加粘彈性模量和線性粘彈區都可以增加泡沫穩定性。實驗結果表明水解可以大大提高大豆蛋白的攪打起泡性質,為大豆蛋白在蛋糕、充氣糖果和冰淇淋等充氣食品的應用開發提供了實際意義。