糖基化反應對白果蛋白免疫原性及結構的影響

孫 紅,楊小明

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013)

白果含有豐富的蛋白質、多糖、內酯類化合物、礦物質元素、胡蘿卜素、維生素、銀杏酸、銀杏醇、銀杏黃素、銀杏黃酮等活性成分,研究發現其具有抗氧化、抗糖尿病、降壓、抗菌等活性功能療效[1],白果作為傳統食品已經食用了數千年,并被加工成各種食品[2]。白果蛋白(ginkgo seed protein,GSP)作為白果內主要活性成分之一,由白蛋白(41.9%)、球蛋白(48.68%)、醇溶蛋白(1.21%)、堿性谷蛋白(3.98%)組成,具有抗氧化、抗菌等活性功能[3-4]。鄧乾春等[5]報道,GSP中的白蛋白在一定程度上能延緩小鼠D-半乳糖誘導的亞急性衰老和自然衰老過程,其機制可能與提高免疫功能和抗氧化能力有關。同時,GSP可增強,GSP可引起I型過敏反應,致敏物主要是分子量為32 kDa的糖蛋白。所以,降低或去除白果蛋白的致敏性是其大規模運用的前提。

食品蛋白質的致敏性與其抗原表位密切相關,降低蛋白的免疫原性可以降低蛋白引發致敏反應的風險[8-9]。蛋白質的抗原表位與其構象表位密切相關,破壞其構象表位能極大降低其抗原表位識別率。蛋白質構象表位可被高溫、高壓、酶解破壞,而這些操作也是去除食品蛋白致敏性的常用工藝[10]。周昊等[11]研究發現,300～700 MPa的高靜壓可通過破壞白果蛋白二級結構,顯著降低其致敏性。同時,堿性蛋白酶和胃蛋白酶處理白果蛋白并分別處于300、400 MPa時,白果蛋白也能得到很好的脫敏效果[12]。而有關糖基化法改變白果蛋白抗原表位、降低其致敏性的研究鮮有報道,故本文嘗試糖基化法降低白果蛋白免疫原性的可行性。

糖基化反應是蛋白質的氨基和還原糖的羥基之間發生一系列非常復雜的非酶促反應,它能夠影響食品的風味、顏色、質地以及營養等品質[13]。同時,有研究報道糖基化反應也能夠對蛋白質的免疫原性產生影響。譚振等[14]在65 ℃、75%相對濕度,蛋白質與糖的摩爾比為1∶14的條件下處理60 h,大豆球蛋白的免疫原性約降低80%。楊崢等[15]發現,牛乳蛋白與低聚糖糖基化后,其免疫原性可降低15%。Bu等[16]發現,β-乳球蛋白與葡萄糖以1∶2.59的比例,在51.8 ℃處理75.7 h,可降低β-乳球蛋白99.68%的致敏性。Lagemaat等[17]采用低聚果糖對大豆分離蛋白進行糖基化,在95 ℃加熱1 h可減少其90%的免疫原性。所以,采用糖基化法降低白果蛋白致敏性是可行的。同時,紫外吸收光譜、熒光發射光譜和圓二色譜等儀器分析已經被用于檢測蛋白糖基化效果,并用于探究糖基化對蛋白結構的影響[16,18-21]。

因此,本文以免疫原性降低程度為優化指標,優化GSP糖基化參數,并借助紫外吸收光譜、熒光發射光譜和圓二色譜分析免疫原性降低和GSP結構變化之間的關聯。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白果 由江蘇大學藥學院鑒定及保存;小鼠 由江蘇大學動物實驗中心提供(SYXK(Jiangsu)2013-0036);辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG 上海碧云天生物技術有限公司;Bovine serum albumin Sigma Company;其他化學試劑 均購自國藥集團化學試劑有限公司。

Sartorius萬分之一電子天平 北京賽多斯依稀系統有限公司;7200型分光光度計 上海天達儀器有限公司;瓦里安Cary100型紫外分光光度計 美國瓦里安技術有限公司;CARY ECLIPSE型熒光分光光度計 美國瓦里安技術有限公司;JASCO J-815型圓二色譜 日本分光公司;3110-P1000型移液槍 德國Eppendorf;HVE-50高壓滅菌鍋 HIPRYAMA制造公司;冷凍離心機BR-4 法國JOUAN公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 GSP的制備 GSP的制備參考楊劍婷等[7]的方法,并略作改動。白果去果殼,冷凍干燥36 h后,研磨成粉,并過40目篩,得到白果粉。使用石油醚對白果粉進行脫脂,重復3～4次,直到白果粉呈白色后,自然沉降,棄去上層石油醚。待石油醚完全揮發,將脫脂的白果粉與TBS(tris buffered saline,0.2 mol/L,pH=7.4)按1∶10 (m/v)的比例混合,4 ℃攪拌24 h,5000 r/min離心15 min,得到上清液。在上清液內加入硫酸銨,提取硫酸銨飽和度在40%～80%的蛋白,5000 r/min離心30 min,得到沉淀蛋白。在沉淀蛋白內加入適量TBS(0.01 mol/L pH=8.0),使用3.5 kDa透析袋,于0.01 mol/L pH=8.0的TBS中4 ℃透析24～36 h。將脫鹽后的GSP溶液進行冷凍干燥,并于-20 ℃保存。

1.2.2 抗GSP血清的制備 取20只健康雄性KM小鼠,6～8周,體重在18～22 g。經過一周適應期后,隨機挑選15只作為GSP組,其余5只作為陰性對照組。配制100、200 mg/mL GSP溶液分別作為GSP組的致敏劑和激發劑,以0.2 mol/L pH=7.4 TBS做為陰性對照組的致敏劑和激發劑。GSP組在第1、7、14 d,以30 μL/g體重的致敏劑進行灌胃致敏,并在第21 d以相同計量進行激發;陰性對照組在相同時間,以相同劑量進行致敏和激發。兩組在激發后1 h進行眼眶取血,室溫靜置3 h后,在4 ℃以1000 r/min離心10 min獲取血清。取5 mL血清與等量的生理鹽水混合,緩慢加入硫酸銨至終濃度為20%,充分混合后,4 ℃放置30 min后,于3000 r/min離心20 min,棄沉淀。上清液中繼續加硫酸銨至濃度為50%,4 ℃放置30 min,經5000 r/min離心30 min,將收集的沉淀復溶于10 mL的生理鹽水中。然后,加入硫酸銨至終濃度為33%,4 ℃放置30 min,后于3000 r/min離心20 min,沉淀以33%飽和度的硫酸銨溶液洗滌2次后,溶解于10 mL生理鹽水中,置于透析袋中在生理鹽水中透析過夜,隨后收集血清,用于IgG測定。

1.2.3 酶聯免疫吸附(ELISA,enzyme-linked immunosorbent)檢測法的建立 采用間接ELISA測定lgG。ELISA的制備方法如下:a.樣品用PBS(1/15 mol/mL pH=8.0)配制為50 μg/mL,每孔加入100 μL,37 ℃孵育2 h,用PBST(含0.05% Tween-20的PBS)洗板5次,每次3 min;b.每孔加入200 μL封閉液BPBST(含1%BSA、0.05% Tween-20的PBS),濕盒中37 ℃孵育2 h,后同上洗板;c.每孔加入100 μL稀釋400倍的血清,37 ℃孵育2 h,同上洗滌;d.每孔加入100 μL稀釋200倍的羊抗鼠IgG-HRP二抗,同上洗滌;e.加入適量底物DAB于37 ℃顯色30 min,每孔加入50 μL 2 mol/L的H2SO4終止反應,使用酶標儀上檢測450 nm下吸光值。陰性對照用PBS代替樣品。

1.2.4 GSP糖基化反應的工藝優化 使用PBS將GSP配制為2 mg/mL的樣品液。固定糖基化條件為蛋白與葡萄糖比例1∶3、糖基化溫度70 ℃、糖基化時間40 min,改變其一設計單因素實驗,采用ELISA檢測法檢測GSP免疫原性,分別研究蛋白與葡萄糖比例(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、糖基化溫度(30、50、70、90、120 ℃)及糖基化時間(10、30、60、90、120 min)對GSP免疫原性的影響。

1.2.5 接枝度的測定 采用鄰苯二甲醛[22](OPA)方法檢測接枝度(DG)。首先,稱取40 mg OPA,溶解于1 mL甲醇中,加入2.5 mL 20% SDS溶液、25 mL 0.1 mol/L硼砂溶液及100 μLβ-琉基乙醇,用蒸餾水定容50 mL。將200 μL的樣品溶液(蛋白含量為2 mg/mL)加入到4 mL OPA試劑中渦旋振蕩,35 ℃下反應2 min,在340 nm下檢測吸光值,來計算游離氨基含量。樣品接枝度的計算如下:

式中:A0表示GSP與葡萄糖以一定比例混合后立即在340 nm的吸光值;A1表示GSP與葡萄糖進行接枝反應后在340 nm的吸光值。

1.2.6 褐變程度的測定 使用0.1% SDS溶液將樣品溶液稀釋至蛋白質量分數為0.2%,10000 r/min離心20 min除去不溶物,以不加樣品的SDS溶液做空白,采用分光光度計在420 nm下測定吸光度A420,以A420表示褐變強度[23]。

1.2.7 紫外光譜的測定 采用單因素優化后的參數對GSP進行糖基化反應,其樣品溶液以10000 r/min離心20 min除去不溶物。采用Bradford法測定水溶蛋白含量[24],使用PBS將糖基化和未糖基化樣品稀釋為1 mg/mL。用紫外分光光度計在200～350 nm波長范圍下掃描各樣品。

1.2.8 熒光光譜的測定 采用單因素實驗優化后的參數對GSP進行糖基化反應,其樣品溶液以10000 r/min離心20 min除去不溶物,使用PBS將糖基化和未糖基化樣品稀釋為1 mg/mL。在激發波長為280 nm,發射波長300～450 nm,激發狹縫寬為5 cm,發射狹縫寬為2.5 cm條件下掃描各樣品。

1.2.9 圓二色譜的測定 采用單因素實驗優化后的參數對GSP進行糖基化反應,其樣品溶液以10000 r/min離心20 min除去不溶物,使用PBS將糖基化和未糖基化樣品稀釋為1 mg/mL。在常溫(25±1) ℃下,掃描速度為50 nm/min,掃描波長范圍為190～250 nm,樣品池光程為0.1 nm,靈敏度為100 mdeg/cm。用平均摩爾橢圓率[θ]來表示CD數據,單位為deg·cm2·dmol-1,進行圓二色譜分析。通過CDPro軟件分析CD色譜圖數據,采用CON-TIN/LL算法計算蛋白質中各二級結構α-螺旋、β-折疊、轉交及無規則卷曲的含量。

1.3 數據處理

每個實驗重復三次,取平均值作為最終結果。采用SPSS軟件,ANOVA 法評估數據的差異顯著性,差異性水平設定為p<0.05。

2 結果與討論

2.1 免疫期間血清內IgG含量變化

圖1為免疫期間血清內IgG含量的變化。如圖1所示,經白果蛋白免疫和激發,小鼠體內IgG水平顯著升高(p<0.05),說明白果蛋白具有免疫原性。同時,血清內產生的IgG可作為體外白果蛋白免疫原性變化的檢測一抗。

圖1 免疫期間血清內IgG含量的變化

2.2 不同蛋白與葡萄糖比例的糖基化對GSP免疫原性的影響

由圖2a可以看出,蛋白/糖比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶10時,相對蛋白糖比為1∶0時,GSP免疫原性分別降低了15.31%、20.24%、35.10%、36.42%和34.45%。隨著葡萄糖的比例逐漸增加且蛋白/糖比例未超過1∶3時,GSP免疫原性隨著葡萄糖比例增加明顯下降。由于葡萄糖比例增大,反應體系粘度上升,分子流動性和擴散性變差,蛋白與葡萄糖糖空間阻礙變大,則反應程度降低,影響接枝反應[25]。蛋白/糖達到1∶3、1∶5、1∶10時,GSP的免疫原性則無顯著性差異,穩定在葡萄糖比例為1∶3的水平。

由圖2b所示,增加葡萄糖且蛋白/糖比例不超過1∶3時,接枝度隨著葡萄糖添加量增加顯著升高,并在蛋白/糖比為1∶3時達到最高值25.20%。繼續增加葡萄糖含量,則引起反應體系粘度增加,而不利于接枝反應,故蛋白/糖比例達到1∶5、1∶10時,接枝度顯著降低(p<0.05)。但GSP褐變程度未隨著葡萄糖添加量增加而加深,說明70 ℃反應40 min并不會引起GSP與葡萄糖出現明顯美拉德褐變。

圖2 不同的蛋白/糖比例對GSP免疫原性及接枝度和褐變程度的影響

因此,結合GSP免疫原性降低程度和接枝程度,確定GSP/葡萄糖比例為1∶3。

2.3 不同糖基化溫度對GSP免疫原性的影響

如圖3a所示,糖基化溫度為30、50、70、90、120 ℃時,相比室溫,GSP免疫原性分別降低了0.08%、3.60%、37.86%、43.14%和60.04%。如圖3b所示,在0～90 ℃范圍內,隨著糖基化溫度增加,GSP-葡萄糖復合物的接枝度逐漸增加,并在90 ℃達到峰值28.7%,且未發生明顯褐變。當溫度達到120 ℃時,GSP-葡萄糖復合物的接枝度出現顯著下降(p<0.05),并發生顯著褐變(p<0.05),這可能是由于反應過程中較高的溫度可以提供更多的能,使反應的速度加快,導致褐變強度增加[26]。糖基化溫度為120 ℃時,GSP的免疫原性最低,但嚴重褐變引起的絮凝沉淀會降低GSP消化吸收率[27]。因此,選擇90 ℃作為較佳糖基化溫度。

圖3 不同糖基化溫度對GSP免疫原性及接枝度和褐變程度的影響

2.4 不同糖基化時間對GSP免疫原性的影響

如圖4a所示,相對未糖基化GSP,糖基化時間為10、30、60、90、120 min,GSP免疫原性分別降低了6.10%、30.52%、53.40%、54.08%和57.92%。在60 min內,隨著糖基化時間增加,GSP免疫原性逐漸降低。當糖基化時間達到60 min以后，GSP免疫原性變化不顯著。如圖4b所示,GSP-葡萄糖復合物的接枝度在0～60 min內,隨著糖基化時間增加,其接枝度逐漸增加,并在60 min達到峰值30.1%。當糖基化時間超過90 min時,接枝度隨著時間增加而降低。同時,在60 min內糖基化反應未引起明顯褐變,但糖基化時間達到90 min時,糖基化會引起嚴重褐變。長時間糖基化引起蛋白質發生變性聚集,導致反應基團包裹在分子內部,且蛋白空間結構中存在大分子立體效應,進而影響接枝物的生成[28]。所以,較佳的糖基化時間為60 min。

圖4 不同糖基化時間對GSP免疫原性及接枝度和褐變程度的影響

2.5 紫外吸收光譜結果

蛋白質的紫外吸收光譜(250～350 nm)與蛋白內色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量密切相關,故波長250～350 nm處的紫外吸收光譜圖可顯示蛋白質分子的構象變化[29]。對糖基化GSP樣品和未糖基化蛋白樣品進行紫外吸收檢測,結果如圖5所示。經糖基化的GSP和未糖基化GSP在280 nm均有吸收峰,且糖基化可以明顯增加GSP在280 nm處的吸光值,說明糖基化引起白果蛋白構象變化。由于蛋白質經糖基化修飾后,其蛋白質的三級結構發生了改變,一方面可能引起疏水基團暴露,另一方面修飾基團也可能使酪氨酸、苯丙氨酸等紫外吸收氨基酸殘基暴露,故糖基化能夠增加280 nm處的吸光值[21,30]。同時,糖基化GSP較未糖基化GSP在280 nm有較強吸收值,也可能部分緣于蛋白質糖基化可以產生輕甲基糠醛,而其在280 nm附近也有紫外吸收[31]。所以,白果蛋白的特征基團被糖基化反應改變,其抗原表位可能也被影響,進而降低白果蛋白免疫原性。

圖5 糖基化反應對GSP紫外吸收的影響

2.6 內源熒光發射光譜結果

內源熒光光譜是檢測過敏原蛋白質三級結構的常用方法。用280 nm波長光激發時,蛋白質的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基受到激發,這些氨基酸殘基的激發能以熒光形式發射出來[32]。處于蛋白質分子表面的發色氨基酸殘基具有350～353 nm的熒光發射峰,而包埋于蛋白質分子內部的熒光發射峰在326～332 nm之間[33]。由圖6可以看出,GSP的熒光發色基團主要在其表面,且其經糖基化后,GSP在340 nm的最大吸收峰減小,說明糖基化反應減少了表面熒光發射基團數量,改變白果蛋白三級結構,故其抗原表位改變而免疫原性降低。

圖6 糖基化反應對GSP的內源熒光發射強度影響

2.7 圓二色譜結果

圓二色譜是一種測定溶液中蛋白質和多肽二級結構的靈敏技術。蛋白質圓二色光譜的遠紫外區屬于肽鍵吸收范圍,反映了蛋白質主鏈的構象,能直接測定蛋白質的二級結構。通常α-螺旋在靠近192 nm有一正的譜帶,在208、222 nm處有2個負的肩峰譜帶;β-折疊在216 nm處有一負譜帶,在185～200 nm有一正譜帶;β-轉角在206 nm附近有一正譜帶;無規則卷曲在200 nm附近有一負峰,在210～230 nm有一正譜帶[34]。由圖7可見,未糖基化GSP在192 nm有一個正吸收峰,在208 nm有一個負吸收峰。當GSP進行糖基化反應后,原有正吸收峰發生藍移,負吸收峰則發生紅移,且兩者強度均有變化,說明糖基化改變了GSP的二級結構,并影響白果蛋白的抗原表位。由表2可見,糖基化反應增加了GSP的α-螺旋和無規則卷曲含量,減少了β-折疊和轉角含量。這可能是由于共價引入單糖鏈,引起的空間位阻效應會抑制蛋白質分子間的聚集,使蛋白質分子空間結構發生變化,導致無規卷曲含量增加[35]。所以,白果蛋白免疫原性的降低可能緣于糖基化反應改變了白果蛋白二級結構和抗原表位。

表2 糖基化后GSP二級結構的變化Table 2 The change about the secondary structure of GSP after glycosylation

圖7 糖基化反應對GSP二級結構的影響

3 結論

采用糖基化的方法降低GSP免疫原性,在保證高效接枝度并防止劇烈褐變的前提下,單因素實驗優化得到的較佳參數為:蛋白/糖比例為1∶3,糖基化溫度為90 ℃,糖基化時間為60 min,且此工藝能有效降低GSP約54%的免疫原性。同時,GSP經糖基化后,其紫外吸收的增加、內源熒光發射的降低以及二級結構的變化,說明糖基化通過暴露GSP的紫外吸收基團,屏蔽熒光發射基團,改變蛋白質三級結構,進而改變GSP的抗原表位,降低其免疫原性。