新型納米模擬酶在食品安全分析中的應用進展

關樺楠,宋 巖,龔德狀,劉 博,張 娜

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076)

食品安全問題關系國計民生,一直是社會各界廣泛關注的焦點[1]。在食品科學領域,酶及其制劑一直被廣泛應用于各個方面。酶法食品分析具有快速分離相似待測物、檢測條件易實現、檢測速度快等優勢,可以用于指示食品生化狀態。但由于天然酶成本高、難于純化和貯藏條件苛刻等問題。在實際食品安全檢測中,食品分析常采用其他化學分析方法和儀器分析法,普遍存在著樣品制備繁瑣、靈敏度和準確度較低、需要專業技術人員和昂貴的設備作為支撐、難以滿足現場快速檢測的要求等缺點[2]。隨著納米材料的開發、制備及應用的成熟,納米粒子已成為監測食品安全性的分析工具?；跓o機納米材料的新型納米模擬酶可代替傳統酶應用于酶檢測法,為食品分析領域提供一項方便快捷、穩定性好、靈敏性高且特異性強的快速檢測方法[3]。本文綜述了新型納米模擬酶的理化性質、種類,以及在食品安全分析中的應用進展,旨在為更好地利用新型納米模擬酶材料,進一步研究開發并將其與電化學法、比色法等檢測方式的結合提供參考,為新型納米模擬酶的性能優化及拓寬應用領域提供理論依據。

1 新型納米模擬酶的概述

1.1 納米酶的理化特性

由于其獨特的納米級特性,如高穩定性、可比活性、生物相容性和低成本,已成為替代天然酶的新型替代材料?；诩{米材料表面的物理化學性質,為改變納米粒子的固有性質、改善催化活性、拓寬納米材料應用范圍,近年來通過形貌粒徑調控、化學摻雜、表面修飾和材料復合設計等改善了納米酶的性能,靈敏調節納米酶活性的外部觸發因子,實現了催化性能可調控、耐受性強、可重復利用的性能突破[4-6]。

1.2 納米酶的優勢

納米酶,也稱納米模擬酶,即具有某種或某些酶特征的納米材料。幾十年來具有催化活性的納米材料被廣泛開發用來模擬天然酶[7]。納米模擬酶是一種新型的酶模擬物,不僅具有納米材料的獨特性能,而且具有天然酶的催化活性。與天然酶和常規人工酶相比,納米酶功能上可依賴于尺寸修飾和生物偶聯的大比表面積,實現催化等其他功能,和對外部刺激的智能響應;應用上具有制備簡單、穩定性高、成本低廉、易于保存運輸、環境耐受性高等優點[7]。不同的材料可以催化類似的反應,其中大部分是氧化還原反應。其機理在于多數無機納米材料具有氧化還原性質,且其反應的機理與酶的催化過程類似。而反應過程中氧化產物的顏色或熒光變化,以及某些底物的顏色變化,都使其成為檢測應用的理想選擇[8]。同時,模擬酶的開發也打破了一些天然酶應用的限制,克服了其穩定性差、提取困難、價格昂貴、催化活性易受多種物理、化學等因素影響而失活的缺陷[9]。

2 新型納米模擬酶材料的種類

近年來,多種納米材料被發現可以模擬天然酶的活性,主要包括金屬納米材料、金屬氧化物納米材料、碳基納米材料、金屬有機框架(Metal-organic frameworks,MOFs)、硫化物納米材料、生物質復合納米材料和其它納米材料[10]。

2.1 金屬納米模擬酶材料

金屬納米材料應用較多的是貴金屬,如金納米粒子及納米棒、銀納米粒子和鉑納米粒[11]。還有一些雙金屬和其它金屬納米材料,如Au@M(M=Bi,Pd和Pt)納米材料,Ag@M(M=Au,Pd和Pt)納米材料[12]。

金屬氧化物納米材料應用較多的為鐵氧化物納米材料和鈰氧化物納米材料,其中鐵氧化物納米材料可作為類過氧化物酶、類過氧化氫酶、類氧化酶等[13],二氧化鈰納米材料可作為超氧化物歧化酶、類過氧化氫酶、類氧化酶等[14]。除此之外,已開發的還有鈷氧化物納米材料(Co3O4)[15],銅氧化物納米材料(CuO)[16],錳氧化物納米材料(MnO2)[17],釩氧化物納米材料(V2O5/V2O3)[18-19],鈦氧化物納米材料(TiO2)[20],鉬氧化物納米材料(MoO3)[21],釕氧化物納米材料(RuO2)[22],雙金屬氧化物MFe2O4(M=Co,Mn,Zn)[23-25]等。

2.2 碳材料納米模擬酶材料

碳基納米材料包括碳納米管[26]、石墨烯及其衍生物[27]、碳納米點[28]、碳納米角[29]、碳納米團簇[30]等,都具有一些酶的活性。金屬有機框架(MOFs)是指由金屬離子與有機配體通過配位鍵連接而成的具有無限結構的多孔材料,種類繁多,也可以模擬天然酶的催化活性[31]。

2.3 氧化物及其復合體模擬酶材料

硫化物納米材料,如CuS、MnSe、FeSe,硫化物的模擬酶活性,相比于金屬氧化物模擬酶在酸性條件下穩定性更好,同時拓寬了硫化物納米材料的應用范圍[32-34]。

復合納米材料是通過組裝不同的納米酶材料,形成的復雜高效的納米酶復合體,如Au-Fe3O4復合物,氧化石墨烯(rGo)-Fe3O4納米復合物[35-36]。

此外,還有一些其它納米材料。普魯士藍納米顆粒也被證明在特定條件下具有多酶性質[37]。少量金屬氫氧化物也被發現可以有效模擬酶的催化性質,如Cu(OH)2、CoFe的雙層氫氧化物[38-39]。

發展至今,納米材料可用來模擬多種酶活性,常用的包括過氧化物酶模擬酶、過氧化氫酶模擬酶、氧化物酶模擬酶、超氧化物歧化酶模擬酶、核酸酶模擬酶、酯酶模擬酶、葡萄糖氧化酶模擬酶和亞硫酸氧化酶模擬酶等,這些納米酶己被廣泛應用于生物傳感、免疫分析、疾病診斷與治療、食品安全控制和檢測及環境監測等領域。其所模擬的活性酶種類、特點及應用范圍詳見表1。

表1 納米材料模擬酶活性特點及應用范圍Table 1 Characteristic and application range of nano-enzyme mimetics activity

3 新型納米模擬酶在食品安全分析中的應用

3.1 新型金屬模擬酶在食品分析中的應用

金納米棒(GNRs)一直被用來提高Pt/Pd納米粒子的表面積以增強其催化活性。Biswas等[45]首次提出了GNRs具有催化性能,合成了縱橫比為2.8的GNRs開發新型納米模擬酶用于農藥馬拉硫磷的簡單比色抑制測定,其過氧化物酶活性比辣根過氧化物酶(HRP)和陽性金納米顆粒高2.5倍,且穩定性高。GNR的催化活性與馬拉硫磷濃度成反比關系。該測定方法特異性強,與有機磷酸酯和金屬鹽的交叉反應小于0.01%,靈敏度為1.78 μg/mL。該研究表明,GNRs具有固有的過氧化物酶活性,這種催化活性可能是由于其表面的正電荷有助于過氧化物自由基的產生和部分電子的轉移過程。GNRs的催化活性在廣泛的pH和溫度范圍內表現出較強的穩定性。此外該研究首次提出了基于GNRs 酶模擬活性與馬拉硫磷濃度之間的反比關系制備簡單比色法的概念,可進一步提高檢測的靈敏度應用于馬拉硫磷的測定。GNRs的催化活性顯示出巨大的潛力,可用于開發各種分子的檢測。

金納米簇(Au NCs)是一種新型的酶模擬物,與天然酶相比,在嚴苛條件下具有更好的穩定性。Fang等[46]以簡便、低成本的方法獲得了熒光蛋殼膜模板金納米簇(Au-ESM),并通過與谷胱甘肽(GSH)的反應過程調節Au-ESM的過氧化物酶活性。此外,模擬酶膜的催化活性可以通過抗原-抗體反應來調節。在目標分子調節催化活性的基礎上,建立免疫法比色測定葡萄球菌腸毒素(SE-B)。該比色法可在0.4～20 ng/mL的濃度范圍內檢測SE-B,檢出限為0.12 ng/mL。在實際應用中,所提出的比色分析可進一步用于檢測面粉,玉米和大米等食品樣品中的SE-B,需要的樣品量極低,具有很高的靈敏度和精密度,為食品中SE-B 的檢測提供了快速現場篩選策略樣品的方法,且成本低廉,可廣泛應用。該項研究中的Au-ESM具有良好的發展前景,可作為目標分子檢測平臺,為開發具有生物醫學和食品安全應用的診斷設備開辟新的途徑。

Au@Pt 納米材料是在GNRs的表面修飾上一層島狀的納米鉑點,He等[47]發現在GNRs外涂有由鉑納米點組成的外殼形成的Au@Pt納米結構具有的氧化物酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性,建立了一種基于Au@Pt NRs的酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠白細胞介素2(IL-2)。與HRP相比,成本低、制備方便、穩定性高、催化活性好,完全克服了天然酶的缺點。此外,可以通過控制結構和合金成分變化進一步定制催化活性,整體結構通過借用內部Au核和Pt納米點的外延生長而具有剛性和良好的光學響應,從而形成穩定有效的酶模擬活性,在生物催化、生物檢測和納米生物醫學方面具有新的潛在應用。

雙金屬納米材料可利用不同組分的協同效應實現多功能催化。Wu等[48]采用簡便、綠色的方法合成了牛血清白蛋白生物分子支架(BSA-Bi/Pt NPs)中的雙金屬Bi/Pt納米顆粒。由于鉍的改性,與Pt NPs相比,Bi/Pt NPs增強了過氧化物酶的催化活性。此外,在高溫、極端pH環境、高離子強度等惡劣條件下以及在常見的生物矩陣中都具有高穩定性。這些突出的優勢使Bi/Pt NPs可以廣泛應用于生物檢測領域,如血糖檢測,細胞外過氧化氫(H2O2)監測,癌細胞標記等,并取得了令人滿意的結果。其中,葡萄糖的檢出限為0.2 mmol/L,線性檢測范圍為1～100 mmol/L。BSA-Bi/Pt NPs可以增強底物的親和力,可廣泛應用于食品分析或醫藥分析領域。

3.2 新型金屬氧化物及其復合體模擬酶在食品分析中的應用

納米Fe3O4過氧化物是催化領域應用的熱點。Ding等[49]基于Fe3O4磁性納米顆粒的模擬酶活性,以2,2′-聯氮-二-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽(ABTS)為底物,建立了Fe3O4MNPs-H2O2-ABTS檢測系統,比色測定乳制品中的三聚氰胺。檢測過程中,三聚氰胺優先與過氧化氫反應,以減少在Fe3O4MNPs催化下使ABTS氧化顯色的過氧化氫量,通過過氧化氫的消耗量實現對三聚氰胺的定量檢測。檢測時間不超過1 h,檢測限為 2.5 mg/kg,回收率在98%～115%之間。該傳感器構建方法簡便,而且可以在不借助任何儀器的情況下，在視覺上評估三聚氰胺的存在。劉細祥等[50]建立了過氧化氫-甲基橙-納米四氧化三鐵模擬酶催化反應體系。其原理是在pH=1.42的HCl-NaAc介質中,納米Fe3O4可催化雙氧水產生羥基自由基迅速氧化甲基橙,體系顏色由紅色逐漸變淺,直至完全褪去,吸光度差隨H2O2濃度的增加而線性降低。該體系用于食品中痕量雙氧水的測定,在優化的條件下,該方法的線性范圍為1.17～35.2 μmol,檢出限為0.6 μmol/L。該方法彌補了納米Fe3O4催化氧化甲基橙分光光度法檢測H2O2的空白,且兼具光度法的簡便性、催化法靈敏度高和成本低等優點,具有廣闊的應用前景。

納米模擬酶與比色技術的結合,為食品比色分析檢測構建了一個新平臺。Qin等[52]發現Co3O4NPs具有氧化酶活性,可以催化氧化顯色底物3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)形成有色產物,亞硫酸鹽的存在抑制了Co3O4-O2-TMB反應體系并引起反應體系顏色的變化。機理為Co3O4NPs的氧化酶活性可能源于它們在過氧化物酶底物和吸附在Co3O4NPs表面上的氧氣分子之間轉移電子的能力,電子傳遞促使TMB被氧化而發生顯色反應,傳遞后又恢復到最初狀態,而亞硫酸根離子空間位阻小于大分子TMB,因此同時存在時會被優先吸附到Co3O4表面而阻止顯色反應?；诖藱C理建立了測定亞硫酸鹽的比色法,用于檢測百合干、山楂卷及粉絲等食品中的亞硫酸鹽,該方法線性關系良好,檢測范圍為 0.2×10-6～1.6×10-5mol/L,最低檢測限為5.3×10-8mol/L,回收率為93.8%～100.5%。Wang等[53]將金納米顆粒(AuNPs)中摻雜了Fe3O4NPs合成Au@Fe3O4納米材料,由于AuNPs和Fe3O4NPs之間的協同作用,Au@Fe3O4納米材料的過氧化物酶活性得到有效增強。在此基礎上,開發了一種比色適體傳感器用于谷物和豆類食品中赭曲霉毒素(OTA)的檢測,具有高特異性,檢測限可以達到30 pg/mL,花生和谷物中OTA的回收率分別為92%～97.2%和96%～108.1%。

在比色分析的基礎上,模擬酶催化理論還可以與化學發光體系相結合。Zhang等[54]發現CoFe2O4NPs具有氧化酶活性,在典型底物TMB、ABTS和鄰苯二胺(OPD)的催化作用下,CoFe2O4NPs可以通過在NaAc緩沖液中溶解的O2催化底物氧化,并產生典型的顏色反應,魯米諾通過溶解氧氧化產生微弱的發射光,CoFe2O4NPs可強化化學發光(CL),峰值位于430 nm左右(與3-氨基鄰苯二甲酸酯的最大發射光譜相同)。在相對較低的濃度水平下,亞硫酸鹽對系統有抑制作用,反之則具有增強效果。兩種狀態下系統的發光體3-氨基鄰苯二甲酸酯陰離子(3-APA*)都處于興奮狀態,如圖1所示。在討論魯米諾-CoFe2O4NPs-亞硫酸鹽CL系統可能機理的基礎上,建立了流動注射化學發光法測定痕量亞硫酸鹽。在最佳條件下,該系統可以響應低至2.0×10-8mol/L的亞硫酸鹽。該方法已用于白葡萄酒樣品中痕量亞硫酸鹽的測定,與標準滴定方法給出的結果一致。該研究較好的改良了檢測體系的靈敏度,拓展了模擬酶催化檢測的應用范圍,將會成為食品分析技術改良的一個新方向。

圖1 魯米諾-CoFe2O4 NP-亞硫酸鹽發光系統的構建原理[49]

3.3 新型碳材料模擬酶在食品分析中的應用

選擇性制備所需結構的復合材料對于提升模擬酶的催化活性具有重要意義。Qian等[55]合成了Fe3O4/石墨烯納米復合材料(Fe3O4NPs/rGO),基于其對TMB顯示出較高的過氧化物酶活性構建比色平臺。利用乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶的特異性催化反應選擇性檢測乙酰膽堿含量,應用于實際牛奶樣品中的檢測,具有較高的置信度和實用性,平均回收率為87.2%～115.2%。

為結合多種改性納米粒子的表面功能及催化活性的應用而開發不同的傳感器,Margarita等[56]用Cu2+-改性氮化碳納米粒子(Cu2+-g-C3N4NPs)和Cu2+-改性碳點(Cu2+-Cdots)作為催化劑模擬辣根過氧化物酶的功能,在魯米諾-H2O2的存在下可以產生化學發光,并催化H2O2氧化多巴胺形成氨基色素。研究發現,這兩種Cu2+改性納米粒子擴大了過氧化物酶活性的pH范圍,且表面功能可以經過化學單元(如環糊精)的進一步改性來增強其催化功能。Cu2+-g-C3N4NPs可用于開發H2O2傳感器,葡萄糖檢測平臺和葡萄糖氧化酶探測傳感器。碳點經改性后,催化效果增強了4倍。利用碳材料高效復合金屬離子和氮化物,可將幾種具有良好模擬酶活性的粒子的優勢在一起,改善催化效果,提升催化速率,進而改良檢測體系的靈敏度和特異性。

二肽(FF)-多金屬氧酸鹽(POMs)-氧化石墨烯(GO)三元雜化物是一種優異的過氧化物酶樣模擬物。Zhuo等[57]通過再沉淀法制備該雜化物,經復聚策略獲得FF和POMs的超分子組合。在室溫條件下,將含有PW12和FF的乙醇溶液以摩爾比1∶3添加到水中,立即產生了丁達爾效應,導致化合物的沉淀。然后進行陽離子二苯丙氨酸肽靜電包封H3PW12O40(PW12)和FF@PW12球與氧化石墨烯(GO)的組裝,見圖2。

圖2 FF@PW12@GO復合體模擬酶構建示意圖[57]

由圖2可知,使用TMB作為顯色底物,在非均相中評估了FF@PW12的過氧化物酶活性,在均質中比原始無包封劑的PW12高13倍。此外,含有重量百分比為5% GO的FF@PW12@GO的三元雜化物可以比FF@PW12的活性提高1.7倍。推測GO和POM之間的氫鍵和離子的非共價相互作用會產生增強過氧化物酶活性的協同效應[57]。利用TMB對紫外可見光的吸收程度與H2O2的濃度的相關性,FF@PW12@GO可被用來檢測H2O2,檢測限為0.11 μmol/L,檢測范圍為1～75 μmol/L。將三個獨立組分集成到一個系統中,從而產生了協同作用,對整體催化性能做出貢獻。為使用POMs引入GO構建H2O2提供了有效途徑[57]。

3.4 新型金屬有機框架納米模擬酶在食品分析中的應用

3.4.1 金屬有機框架納米模擬酶在食品分析中的應用 金屬有機框架(MOFs)是一種具有柔性結構的功能材料。Qi等[58]設計并制造了一種能夠為過氧化氫的催化反應發出熒光的PA-Tb-Cu MOF雙功能納米酶,不僅具有優異的催化活性,而且可以實時熒光指示催化過程中H2O2的濃度直至低至0.2 μmol/L。這種納米酶由發光Tb3+,催化Cu2+和鄰苯二甲酸(PA)作為橋接配體組成。Tb3+是一種發光離子且具有較長的熒光壽命,Cu2+是許多輔基的關鍵催化中心。酶催化反應直接由功能性離子/分子組裝,用于取代天然酶和顯色劑的常見組合使用。另外,基于Tb3+的發光納米酶不受生物系統自發熒光的影響。Qi等進一步利用PA-Tb-Cu MOF和抗壞血酸體系測定牛奶樣品中的H2O2,PA-Tb-Cu MOF和AA的發光催化分析反應見圖3。牛奶樣品中的H2O2測量回收率為91.50%～108.5%,該方法能夠滿足牛奶中的H2O2測定,具有較高的精度和良好的重復性。

圖3 用PA-Tb-Cu MOF納米酶催化抗壞血酸+H2O2體系[58]

3.4.2 共價有機框架納米模擬酶在食品分析中的應用 共價有機框架(Covalent organic frameworks,COFs)應用廣泛,是近來備受關注的多孔聚合物。然而,COF材料作為酶模擬物的催化應用仍然在很大程度上未被探索。Wang等[59]首次成功合成鐵-卟啉-基于共價有機骨架(鐵-COF)，在H2O2存在下,Fe-COF可以催化底物TMB以產生顏色,表明它具有過氧化物酶活性。此外,動力學研究表明Fe-COF納米材料對基質H2O2和TMB的親和力高于天然酶辣根過氧化物酶(HRP)。在優化條件下,將Fe-COF納米材料應用于比色傳感器中,用于H2O2的靈敏檢測。檢測范圍為7～500 μmol/L,檢測限為1.1 μmol/L。此外,Fe-COF與葡萄糖氧化酶(GOx)相結合,可采用一鍋法測定葡萄糖,如圖4所示,檢測范圍為5～350 μmol/L,檢測限為1.0 μmol/L。作為過氧化物酶的模擬物,具有制備簡便、穩定性好、催化效率高等優點?；谝陨戏椒?有助于促進COF復合材料作為酶模擬物的應用。

圖4 Fe-COF作為催化劑的葡萄糖檢測比色傳感器的原理示意圖[59]

3.5 新型生物質復合型納米酶在食品分析中的應用

作為分析化學的一個重要研究領域,葡萄糖生物傳感器由于其在各領域的廣泛應用而備受關注。Wang等[60]制造了一個人工酶體系GOx@ZIF-8(NiPd)納米花實現串聯催化,如圖5所示。通過簡單的共沉淀,納米酶(NiPd空心納米粒子)和天然酶(葡萄糖氧化酶)同時固定在ZIF-8上。GOx@ZIF-8(NiPd)不僅表現出NiPd的過氧化物活性,而且保持了GOx的酶活性。利用OPD作為顯色基板,生成黃色氧化產物鄰苯二甲酸二丙烯酯(DAP),可以在一個步驟內實現葡萄糖視覺檢測的級聯反應。該體系為納米粒子與天然酶之間的合作架起了橋梁,結合了各自的功能特性,實現了高效的串聯催化反應,建立了一種用于檢測葡萄糖的安培生物傳感器。

圖5 GOx@ZIF-8(NiPd)人工酶系統串聯催化示意圖

金納米粒子已被證明是具有天然葡萄糖氧化酶活性的有效納米粒子,它可以催化葡萄糖氧化,生成H2O2。以金納米粒子具有酶活性為基礎,Lin等[61]研制了一種混合催化劑,如圖6所示。石墨烯-中孔二氧化硅混合物(GS)被用作納米容器,在不同的位置固定金納米粒子(用作GOx模仿劑)和生物質血紅素(用作過氧化物酶類似物),含有多個催化位點的集成催化劑可用于催化反應,而無需真正酶的幫助。這兩種方法都可以在串聯催化反應中成功地用于葡萄糖檢測。

圖6 GSHA系統中串聯反應示意圖[55]

4 結論與展望

本文總結了近年來新型納米模擬酶在食品分析方面的研究進展。新型納米模擬材料的不斷開發應用正在逐漸拓寬其在各個領域的應用范圍。在食品分析領域,納米模擬酶催化效率高,成本低,穩定性好,易于制備和儲存的優勢,逐漸取代了天然酶的應用。雖然納米模擬酶的應用已經取得了很大進展,但在這一前沿仍然面臨許多挑戰。鑒于天然酶的多樣性,今后的工作重點應放在設計具有新催化性能的納米粒子上。大多數納米酶很難像天然酶那樣催化一種特定的底物,因此為了模擬復雜的天然酶系統,不僅要提高納米粒子的選擇性,還要根據納米粒子和天然酶的性質功能將二者結合,完成可以高效催化的人工酶系統的組裝,為智能、多功能人工酶的設計開發提供新的途徑。另外,有必要開發合適的納米酶來構建基于酶的電化學生物傳感器,基于納米粒子的表面改性調整其催化活性在生物傳感應用中的作用。為擴大納米模擬酶應用范圍,可以將具有特殊納米性能的納米粒子相結合產生協同作用效果。最后,還需深入挖掘與完善納米粒子模擬天然酶的詳細催化機制和理論。