前體和真菌誘導子對大豆懸浮培養細胞中異黃酮積累的影響

劉 瑞,胡煥煥,石曉衛,豐慧根

(1.新鄉醫學院三全學院生命科學技術學院,河南新鄉 453003;2.新鄉醫學院研究生處,河南新鄉 453003)

大豆異黃酮是大豆生長過程中產生的次生代謝物,可以預防和治療骨質疏松、心血管疾病、婦女絕經綜合癥、與激素相關的各種癌癥,具有抗氧化、清除自由基及誘發癌細胞凋亡等作用,廣泛應用于醫療、保健領域[1]。作為多功能性健康食品,大豆異黃酮具有較好的開發前景[2]。大豆異黃酮主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中,胚軸中異黃酮含量較高,為1%～2%,但由于胚只占種子重量的2%,限制了大豆異黃酮的生產[3]。植物細胞懸浮培養生產次生代謝產物的技術已經比較成熟,是高效生產大豆異黃酮的重要途徑。

組織培養材料的遺傳特性是影響植物組織培養和細胞培養積累次生代謝物質的重要因素[4]。選擇異黃酮含量高的品種及外植體誘導愈傷組織,對獲得高產異黃酮細胞懸浮體系甚為關鍵。在植物細胞懸浮培養過程中,常用添加前體或誘導子的方法提高次生代謝產物的含量。異黃酮是由苯丙烷類代謝途徑的分支所形成的次生代謝產物,苯丙氨酸和乙酸是黃酮類生物合成的重要前體[5]。楊英、高麗華等[6-7]分別在脹果甘草和水母雪蓮懸浮細胞中添加苯丙氨酸(Phe)或乙酸鈉(NaAc),均促進了黃酮類化合物的積累。真菌能產生誘導植物合成次生代謝物的活性物質,如寡聚糖、β-葡聚糖、幾丁質寡糖、糖蛋白、蛋白質和多肽等,因此在植物細胞培養中常被用作誘導子來提高次生代謝產物的含量[8]。青霉(Penicillium)和黑曲霉(Aspergillusniger)是自然界普遍存在的兩種真菌,兩種誘導子也被廣泛應用于不同植物細胞中萜類、生物堿、皂苷等物質的合成,并取得一定成果[9-10]。但青霉和黑曲霉作為誘導子對大豆懸浮細胞生產異黃酮的影響少有報道。

因此,本研究以高異黃酮含量的品種龍野01-491為材料,以其下胚軸為外植體,進行愈傷組織誘導,建立細胞懸浮培養體系。在此基礎上,添加不同的前體(L-phe、NaAc)、生物誘導子(青霉誘導子、黑曲霉誘導子),分析其對異黃酮產量的影響,以期為細胞工程技術生產大豆異黃酮藥物或功能性食品提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆:龍野01-491 黑龍江省農業科學院作物育種研究所提供的高異黃酮含量大豆品系;黑曲霉 編號GIM 3.613,廣東省微生物菌種保藏中心;青霉 編號GIM 3.106,中國普通微生物菌種保藏管理中心;大豆黃素、染料木黃酮、大豆苷、染料木苷 Sigma;冰乙酸、甲醇 天津彪仕奇科技發展有限公司;二乙酸熒光素(FDA)、乙酸鈉(NaAc)、L-苯丙氨酸(L-phe)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1-萘乙酸(NAA)、NaClO、濃H2SO4、蔗糖、瓊脂粉、水解乳蛋白(LH) 國藥集團化學試劑有限公司;MS培養基 青島高科園海博生物技術有限公司。

MGC-450HP人工智能光照培養箱 上海一恒科技有限公司;ZWYR-2102C雙層恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;Nikon E600熒光顯微鏡 日本Nikon公司;GWA-UP型超純水器 北京普析通用儀器有限責任公司;VARIAN Prostar240高效液相色譜儀 美國VARIAN公司;DS-1型電動高速組織勻漿機 江蘇江陰科研器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 愈傷組織的誘導 龍野01-491為野生大豆,種皮呈褐色且稍厚,參考張秀玲、朱學藝等[11-12]的方法并略作改動，進行種子脫毒、發芽和下胚軸愈傷組織的誘導。先用刀片將種子破皮,濃H2SO4處理5 min,用75%酒精處理30 s,無菌水沖洗1次,1% NaClO處理5 min,無菌水清洗4～5次。將脫毒后的種子接入含3%蔗糖的1/2 MS固體培養基中,待種子發芽3 cm左右時,取下胚軸。以下胚軸為外植體,接入到含0.5 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、100 mg/L LH的MS固體培養基上誘導愈傷組織[13];培養條件:25 ℃,暗培養,培養2周。

1.2.2 細胞懸浮培養體系的建立 參考梁曉芳等[13]方法。取質地疏松、生長旺盛的愈傷組織15 g,接種到100 mL含0.8 mg/L 2,4-D、30 g/L蔗糖的MS液體培養基的250 mL三角瓶中,110～120 r/min,25 ℃,暗培養,振蕩培養3 d,依次用60、200目尼龍網過濾,除去愈傷組織碎片和細胞團,獲得懸浮細胞體系。

1.2.3 大豆懸浮細胞生長特性的檢測 按4 g/L(細胞干重計)細胞密度接種,并使接種后的體積為30 mL,于0、3、6、9、12、15 d取搖瓶細胞懸液,測細胞生物量,繪制懸浮細胞生長曲線。取1滴細胞懸液于載玻片上,加一滴0.04 mg/mL FDA溶液,常溫作用5 min,加蓋玻片,熒光顯微鏡下觀察細胞形態和活性。

1.2.4 細胞生物量的測定 取大豆懸浮細胞培養物,抽濾,50 ℃烘干至恒重,稱重,每次三個重復。細胞生物量為每瓶(每30 mL培養物)收獲的細胞干重(g/flask(瓶))。

1.2.5 異黃酮的提取及測定

1.2.5.1 標準溶液的配制及標準曲線的繪制 精密稱取大豆苷、染料木苷、大豆黃素、染料木黃酮各5.0 mg,均用80%甲醇溶解并定容至10 mL,配制成0.5 mg/mL的四種標準品標準貯備液。分別取四種標準貯備液各1.0、0.5、0.25、0.125 mL,用80%甲醇稀釋并定容至10 mL,配制50、25、12.5、6.25 μg/mL標準系列溶液。0.45 μm濾膜過濾,供高效液相色譜檢測,以大豆異黃酮各單體濃度X(μg/mL)為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制四種標準品的標準曲線,其回歸方程分別為:Y=1.6304×105X+9.6333×105(R2=0.9993);Y=1.8483×105X+8.9980×105(R2=0.9989);Y=3.5701×105X+2.5849×106(R2=0.9969);Y=1.7681×105X+3.8145×105(R2=0.9997)。

1.2.5.2 異黃酮的提取 參考程真真等[14]方法。將細胞樣品粉碎,過60目,以1∶1000 (m∶V)向樣品中加入80%甲醇,超聲提取30 min,5000 r/min離心15 min,取上清,0.45 μm濾膜過濾,得待測樣品液。

1.2.5.3 高效液相色譜條件 依據張曉波、賈蕓等[15-16]HPLC檢測方法進行改良。HPLC檢測條件:色譜柱:ODS-BP C18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm);流動相:甲醇∶2.2%冰乙酸=50∶50 (V∶V);柱溫:50 ℃;檢測波長:254 nm;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;進樣時間:20 min。四種標準品混合進樣,出峰順序為:大豆苷、染料木苷、大豆黃素、染料木黃酮。

1.2.5.4 異黃酮含量與異黃酮產量的測定 異黃酮含量為細胞內四種異黃酮含量之和,代表細胞合成異黃酮的能力,本文以1 g干細胞中的4 種異黃酮的總質量表示,單位為mg/g。

異黃酮含量(mg/g)=X·V/m

式中:X為根據標準曲線計算的各異黃酮濃度;V為抽提定容體積;m為樣品質量。

異黃酮產量是確定培養條件下培養瓶中細胞的異黃酮總產量,本文以每瓶(30 mL培養物)中的總異黃酮質量表示,單位為mg/flask。

異黃酮產量(mg/flask)=細胞干重(g/flask)×異黃酮含量(mg/g)。

1.2.6 添加前體對大豆懸浮細胞生物量、異黃酮含量及異黃酮產量的影響 分別在細胞培養的0、9 d,向大豆細胞懸浮體系中分別添加不同濃度的經過濾除菌的NaAc(10、50、80、100 μmol/L)和L-Phe(50、80、100、150 μmol/L溶液),每組三個重復,以不加前體的培養液作為對照,12 d時收獲細胞,考察其對細胞生物量、異黃酮含量、細胞總異黃酮產量的影響。

1.2.7 添加誘導子對大豆懸浮細胞生物量、異黃酮含量及異黃酮產量的影響 參考文濤等的誘導子制備方法[17]。將青霉和黑曲霉的凍干菌種,分別接種在馬鈴薯固體培養基上,28 ℃活化培養4 d,接種到馬鈴薯液體培養基中,28 ℃,120 r/min搖床震蕩培養5 d,4層紗布過濾收獲菌絲體。菌絲體經0.05 mol/L(pH7.0)的磷酸緩沖液洗滌3次,1 g菌絲沉淀重懸浮于10 mL水中,2000 r/min勻漿5 min,4000 r/min離心10 min,棄沉淀,上清液于121 ℃下滅菌20 min,即為真菌誘導子。向裝有30 mL細胞培養液的搖瓶中分別添加不同量的黑曲霉和青霉誘導子,每組三個重復,以不加真菌誘導子的培養液作為對照。

1.3 統計分析

采用SPSS軟件,用LSD法進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 大豆下胚軸的愈傷組織

大豆下胚軸在愈傷組織誘導培養基上,誘導6 d即出愈,脫分化程度良好、質地疏松、黃白色、生長良好(圖1)。

圖1 下胚軸愈傷組織

2.2 懸浮培養大豆細胞的生長和異黃酮的合成與積累

愈傷組織建立的細胞懸浮體系,細胞懸液呈乳白色。經FDA染色,熒光顯微鏡下觀察發現,大豆懸浮細胞較大,形狀主要為類圓形、桿狀和長條狀,細胞活性較強,發出明亮的綠色熒光(圖2)。

懸浮培養的大豆細胞的生長曲線和細胞的異黃酮合成曲線如圖3所示。大豆細胞生長曲線呈S形,0～3 d為滯后期,3～9 d為對數期,9～15 d為穩定期。在0～6 d,異黃酮的含量增加緩慢;6～12 d,異黃酮含量迅速增加;12～15 d,異黃酮含量稍有下降,且無顯著性差異(p>0.05)。細胞異黃酮積累如圖3所示,異黃酮產量在0～3 d增長緩慢;第3 d起,雖然細胞合成異黃酮緩慢,但是細胞已進入對數生長期,異黃酮產量也迅速增加,并在12 d達到最大值(3.86±0.20) mg/flask。選擇在細胞培養12 d時收獲細胞并獲取異黃酮。

圖3 大豆懸浮細胞生長曲線、異黃酮合成及異黃酮積累曲線

在細胞懸浮培養過程中添加前體和誘導子,可能提高細胞中次級代謝產物的含量,但也有可能抑制細胞的生長[6]。在不少的研究報道中,前體和誘導子的添加策略一般是在細胞已長至較高密度的對數生長期末期加入有助于次生物代謝物合成的物質[7]。但是,Chen等在細胞懸浮培養初期時,向其中加入苯丙氨酸,紫杉醇產量提高了10倍[18]。因此,選擇在大豆細胞懸浮培養初期0 d和對數生長末期9 d加入前體和誘導子,考察不同前體和真菌誘導子對大豆細胞生長和異黃酮積累的影響。

2.3 前體對懸浮細胞異黃酮積累的影響

2.3.1 L-phe 分別在細胞培養的0、9 d添加50、80、100、150 μmol/L L-phe,12 d時收獲細胞,稱細胞干重,測細胞異黃酮含量,結果如圖4。圖4結果表明,在細胞培養0 d添加L-phe,50～80 μmol/L L-phe對細胞生長無明顯抑制作用,而100～150 μmol/L的L-phe對細胞生長有抑制作用;而9 d時加入L-phe對細胞生長明顯起促進作用,在50～150 μmol/L范圍內,隨著L-phe濃度的增大作用減小。結果提示,9 d時加入L-phe更有利于大豆細胞生長。檢測不同處理組細胞中異黃酮含量,結果發現,9 d加入L-phe時,不同濃度處理組的異黃酮含量均高于對照(8.57±0.25) mg/g,具有顯著性差異(p<0.05);在50～100 μmol/L范圍內,異黃酮含量隨著L-phe濃度的增大而增大,濃度為100 μmol/L時達到最大,異黃酮含量為(21.41±0.18) mg/g,是對照的2.50倍;當L-phe濃度為150 μmol/L時,異黃酮含量有所降低。

圖4 L-Phe對大豆懸浮培養細胞異黃酮積累的影響

由細胞生物量和異黃酮含量計算所有細胞的異黃酮總產量,結果如圖4所示。從圖4可以看出,以L-phe作為前體飼喂大豆懸浮細胞生產異黃酮時,第9 d添加L-phe優于0 d時添加,且當L-phe濃度為100 μmol/L時,異黃酮的產量達到最高(12.52±0.51) mg/flask,是對照組產量(3.88±0.08) mg/flask的3.23倍。結果提示,以L-phe作為前體飼喂大豆懸浮細胞生產異黃酮時,應在細胞培養9 d加入,最佳添加濃度為100 μmol/L。

2.3.2 NaAc 以NaAc作為異黃酮的前體物質添加在大豆懸浮細胞培養體系中,并使其最終濃度為10、50、80、100 μmol/L。結果如圖5所示,0 d加入低濃度(10～50 μmol/L)NaAc對細胞生長影響不顯著,高濃度(100 μmol/L)NaAc抑制細胞生長;而9 d加入10～100 μmol/L NaAc,與對照組相比細胞干重均增加,對細胞生長明顯起促進作用,但隨著濃度的增大,促進細胞生長的作用減弱。提示高濃度(100 μmol/L)NaAc不利于細胞生長。雖然,在9 d 時添加NaAc有利于大豆細胞的生長,但是9 d時加入不同濃度的NaAc,與對照相比,異黃酮含量均降低;而在實驗濃度范圍內,0 d添加NaAc促進異黃酮合成的作用優于9 d,NaAc濃度為50 μmol/L時細胞內異黃酮含量達到最高為(10.03±0.13) mg/g,與對照相比具有顯著性差異(p<0.05),是對照的1.17倍,當NaAc濃度升高時,細胞內異黃酮含量下降。

由細胞生物量和異黃酮含量計算異黃酮產量。圖5可以看出,在懸浮培養0 d時加入80 μmol/L NaAc,異黃酮產量達到最大(5.55±0.36) mg/flask,是對照組的1.43倍。

圖5 NaAc對大豆異黃酮積累的影響

2.4 真菌誘導子對懸浮細胞異黃酮積累的影響

2.4.1 黑曲霉誘導子 向大豆懸浮培養體系中添加0.1、0.5、1.0、1.5 mL的黑曲霉誘導子,結果如圖6所示。在搖瓶培養0 d加入0.1～1.5 mL黑曲霉誘導液,均不同程度地抑制了細胞的生長,實驗中發現誘導子添加3 d后,細胞出現明顯褐化現象;在9 d時加入黑曲霉誘導子促進了細胞的生長,但隨著添加濃度的增大,促進細胞生長的作用減弱。第9 d添加(0.1～1.0 mL)黑曲霉誘導子均有利于細胞合成異黃酮,不同處理組的異黃酮含量與對照組均具有顯著性差異(p<0.05)。在第9 d加入黑曲霉誘導子添加量為0.5 mL時,異黃酮含量達到最大,為(11.15±0.21) mg/g,是對照組的1.29倍。

圖6 黑曲霉誘導子對大豆異黃酮積累的影響

在第9 d加入黑曲霉誘導子,既有利于細胞生長,也促進了異黃酮的合成。因此,在此時加入黑曲霉誘導子優于0 d時誘導的效果。當黑曲霉誘導子添加量為0.5 mL時,異黃酮產量均達到最大,為(7.25±0.30) mg/flask,是對照的1.82倍。

2.4.2 青霉誘導子 向大豆懸浮培養體系中添加0.1、0.5、1.0、1.5 mL的青霉誘導子,結果如圖7示。與黑曲霉誘導子結果相似,9 d向大豆細胞懸浮液中加入0.1～1.5 mL青霉誘導子,均能明顯促進細胞的生長,但隨著青霉誘導子量的增加,促進細胞生長的作用減小;且不同添加量的處理組,異黃酮含量均增加,與對照組均具有顯著性差異(p<0.05),其中,1.0 mL青霉誘導子可使異黃酮含量達到最高為(17.15±0.10) mg/g。綜合細胞生物量和異黃酮含量,青霉誘導子為0.5 mL時,異黃酮產量達到最大(10.20±0.17) mg/flask,是對照組異黃酮產量(3.99±0.08) mg/flask的2.56倍;在0.5～1.5 mL范圍內,隨著青霉誘導液加入量的增加,異黃酮產量降低。青霉和黑曲霉誘導子均在9 d添加時異黃酮產量達到最高,說明在大豆細胞培養對數生長期末期,大豆細胞對青霉和黑曲霉誘導子的誘導作用具有較強的反應能力。

圖7 青霉誘導子對大豆異黃酮積累的影響

3 討論與結論

前體物質是終端次生代謝產物在生物體代謝途徑中的中間體,前體飼喂可有效提高目標代謝產物產量。異黃酮類物質合成途徑是類黃酮代謝途徑的一個分支,由苯丙氨酸和丙二酰輔酶A經苯丙氨酸裂解酶(PAL)、香豆酸輔酶A連接酶(4CL)等酶催化,經過羥基化、甲氧基化和烷基化過程形成的[19]。從代謝途徑上看,Phe是異黃酮代謝途徑中重要的的合成前體物,乙酸也是黃酮類生物合成的重要前體之一。

楊英等[6]認為前體飼喂可能有利于提高細胞內次級代謝產物的含量,但同時也可能會抑制細胞的生長。前體的最佳添加濃度非常重要。本研究發現,添加合適濃度的L-phe和NaAc均能促進大豆異黃酮的產量,與楊英、高麗華等的結果一致[6-7]。在大豆懸浮體系中添加100 μmol/L L-phe和80 μmol/L NaAc,一方面,對細胞的生長沒有明顯的抑制作用,且作為代謝過程中的中間產物,促進了異黃酮的合成;另一方面,合適濃度的L-phe和NaAc能增加苯丙烷類合成途徑的起始酶——苯丙氨酸裂解酶(PAL)的活性,可為后面的合成步驟提供更多前體,從而提高了異黃酮的產量,使其達到最大[6]。在體系中添加高于最佳添加濃度的前體時,例如:在搖瓶培養的第9 d添加高濃度150 μmol/L L-phe,發現產生細胞毒性,細胞生長速率下降,細胞生物量降低;異黃酮含量雖然高于對照,但是仍低于100 μmol/L L-phe處理組,異黃酮合成減少,最終導致異黃酮產量達到不到最高。在加入較低濃度(50 μmol/L)L-phe時,細胞生長最快,但細胞內異黃酮含量較低,最終的異黃酮產量也達不到最高。本研究結果發現,NaAc促進異黃酮積累的作用比L-phe弱,這與吳桂容等[20]L-phe和NaAc對雞血藤細胞產異黃酮的影響研究結果一致。推測由于乙酸是聚乙炔類、大環抗菌素類、多酚類、類異戊二烯的前體,代謝途徑分支較多,NaAc提供的乙酸根離子可能較多地參與脂肪酸類、萜類以及其它黃酮類化合物的合成而造成的[21]。

本研究實驗了接種初期和對數生長期末期添加L-phe和NaAc對大豆懸浮細胞異黃酮積累的影響,發現不同時間添加前體物質具有不同的效果。L-phe在第9 d添加優于在0 d添加,而NaAc在0 d添加較好,說明不同前體適宜的添加時間不同。細胞懸浮培養過程中,要尋找合適的時間添加外源前體來提高目的產物的產量。L-phe在9 d時添加時,一方面,9 d時細胞積累了足夠的初級代謝產物,加入合適濃度的L-phe促進了異黃酮的合成,異黃酮含量增加,從而達到促進異黃酮積累的目的;另一方面,9 d時,細胞活性仍較好,但是細胞培養液中營養成分已經消耗殆盡,實驗濃度范圍內的L-phe對大豆細胞無毒性,是細胞生長的營養成分,參與細胞蛋白質合成和作為碳源和氮源促進細胞的生長,細胞生物量增加[8]。在9 d時添加50 μmol/L NaAc時,雖然獲得細胞生物量較高,但是異黃酮合成量均低于0 d添加不同濃度NaAc的所有處理組;在0 d時添加80 μmol/L NaAc時,雖然沒有對細胞生長起明顯促進作用,但是異黃酮合成增加,異黃酮含量在此時高于9 d時添加不同濃度NaAc的所有處理組,最終結果顯示,0 d時添加80 μmol/L NaAc的異黃酮產量最大。因此,在添加前體時需要找到懸浮細胞生物量與次生產物含量之間的平衡點,才能獲得最高的產量[22]。

真菌誘導子是來源于真菌的一種確定的化學信號。它能快速、高度專一和選擇性地誘導植物特定基因的表達,進而活化特定次生代謝途徑,積累特定的目的次生產物[9]。真菌誘導子能有效促進植物次生代謝產物的積累,其誘導效果與真菌誘導子的種類、濃度和作用時間等因素密切相關[23]。真菌誘導子誘導次生代謝產物的積累有最適濃度,當真菌誘導子的濃度過高時會抑制次生代謝產物的合成和積累。本研究中,在9 d添加真菌誘導子時,0.5 mL的青霉誘導子和黑曲霉誘導子對異黃酮的積累作用最顯著,但隨著加入量的增加,效果減弱,與熊瓊瓊、呂建軍等研究結果基本一致[9,24]。推測誘導子濃度過大(1～1.5 mL)時,一方面,高濃度誘導子的細胞毒性增強,降低了大豆細胞生長速率,導致異黃酮減少;另一方面,可能抑制了PAL的活性,導致異黃酮合成減少,最終異黃酮的產量下降[25]。

真菌誘導子的作用效果還依賴于培養細胞的生理狀態,只有處于一定生長時期的細胞才能有效地接受誘導信號[24]。在本研究中,在0 d時加入青霉和黑曲霉誘導液均抑制了細胞的生長,細胞生物量顯著降低;9 d加入青霉或黑曲霉誘導子,在合適的濃度范圍內,沒有對細胞生長產生抑制作用,且促進了目的代謝產物的合成,有利于產物的積累,與熊瓊瓊、呂建軍等結果一致。究其原因:0 d時,細胞還沒有適應新的培養環境,且活性較低,真菌誘導子加入后快速地引起Ca2+、H+內流,培養液pH升高,不利于細胞吸收營養物質,嚴重的細胞毒性抑制了細胞的生長,同時對其代謝損傷較大,從而抑制了次生代謝產物的積累[8,25];對數生長末期的細胞密度較大,且細胞活力仍較高,生長和代謝相對旺盛,此時加入一定濃度的外源黑曲霉誘導子或青霉誘導子,能充分接受誘導信號,激活苯丙烷類途徑中的PAL等異黃酮合成限速酶,加速了異黃酮的合成,使細胞內的異黃酮含量和異黃酮產量增加[26]。

本研究利用高異黃酮含量的龍野01-491大豆品系的下胚軸誘導愈傷組織,并建立大豆細胞懸浮培養體系,就前體和真菌誘導子在提高大豆懸浮細胞異黃酮積累的方法進行了探討。結果表明,前體(L-phe和NaAc)、真菌誘導子(黑曲霉誘導子和青霉誘導子)均可以在一定程度上提高大豆懸浮培養細胞異黃酮的產量。雖然前體和真菌誘導子的分別添加能在一定程度上提高大豆懸浮細胞異黃酮的產量,但誘導子和前體的作用機制并不重疊,兩者具有協同添加的基礎[21]。目前,使用前體和真菌誘導子的協同作用提高異黃酮產量的報道較少。因此,在本研究的基礎上,進一步研究前體和真菌誘導子的協同作用,是提高大豆懸浮細胞產異黃酮的又一重要課題。