基于網絡藥理學的谷糠結合態多酚抗乳腺癌機制研究

李帥濤，張立超，剌曉琴，李愛平，武海麗，李卓玉,2,*

1山西大學生命科學學院；2山西大學生物醫學研究院；3山西大學生物技術研究所；4山西大學中醫藥現代研究中心，太原 030006

谷子(Setariaitalica)，學名栗，是我國傳統優勢作物，含有豐富的蛋白質、維生素和微量元素，具有很高的營養價值，在我國廣泛種植[1]。而谷糠作為谷子加工過程中的副產品，往往被人們所忽視，有研究表明谷糠含有豐富的植物化學物質，如多酚等，具有廣泛的生物學特性和藥理反應[2]。有研究表明植物多酚具有抗氧化、調控細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡等，從而抑制癌細胞的增殖[3]。

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤之一，主要由乳腺導管上皮出現惡性改變而發生[4]。近年來，乳腺癌發病率不斷增加，已經嚴重威脅了我國女性的身心健康[5]。乳腺癌的發生有許多內源和外源的因素參與其中，是一個長期的、多因素的過程[6]。目前，手術及放化療仍是治療乳腺癌的主要方式，但治療過程往往帶來嚴重的副作用[7]。本課題組前期研究發現BPIS對人肝癌細胞、宮頸癌細胞以及結直腸癌細胞等多種癌癥細胞均有顯著的抑制作用[8]，尤其能夠顯著抑制乳腺癌細胞的活性，但對正常乳腺細胞沒有明顯影響，因此探明其具體作用機制將擴展臨床治療手段，減輕副作用，對乳腺癌的治療具有重要意義。

網絡藥理學能夠通過計算機模擬算法、運用組學、高通量篩選及網絡分析等技術揭露藥物-靶點-疾病之間復雜的網絡信號關系，已經成為揭示生物系統復雜功能和行為的有力工具[9]。網絡藥理學從系統生物學和生物網絡角度對藥物的作用機制進行整體分析，具有高通量、快速、靈敏和準確的特點[10]。因此運用網絡藥理學對BPIS抗乳腺癌作用的靶點與通路進行篩選，構建BPIS的成分-靶點-疾病網絡模型，從系統生物學的角度對BPIS抗乳腺癌的可能作用機制進行整體闡釋，為后續具體作用機制的研究以及特殊醫藥食品的開發提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

谷子品種為晉谷21號，產地為山西省晉中市，由山西省天下谷公司提供。人乳腺癌細胞MDA-MB-231(南京恩晶生物科技有限公司)；人乳腺癌細胞MCF-7和正常乳腺細胞MCF-10A(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；RPMI-1640 Medium培養基、DMEM/F-12培養基和DMEM High Glucose培養基(山西百奧生物技術有限公司)；青鏈霉素(100X，北京索萊寶科技公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；胰蛋白酶(北方同正公司)；CO2細胞培養箱(Eppendorf Galaxy 170S)；倒置顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 BPIS對乳腺癌細胞活性檢測

人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231和人正常乳腺細胞MCF-10A均培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素的培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。等到細胞長滿貼壁，用胰酶消化、1 000 rpm離心制成細胞懸液，接種到12孔板中，細胞濃度為1×105/孔。細胞貼壁后棄掉培養基，加入1 mL含BPIS的新培養基，BPIS濃度為2、4、8 μg/mL。加藥處理24 h后，在顯微鏡下觀察細胞形態，并用血球計數板進行計數。

1.3 BPIS活性成分的鑒定

稱取一定量的谷糠，用80%的預冷丙酮室溫攪拌2 h(谷糠，丙酮物料比為1∶20)，靜置20 min后棄上清，用NaOH(2 mol/L)于室溫下攪拌1 h(物料比1∶10)。加適量HCl終止消化，調節PH為7。11 000 rpm，離心5 min，取上清。上清中加入乙酸乙酯(乙酸乙酯∶上清=1∶1)進行脫脂，靜置10 min，11 000 rpm，離心10 min，取上清，重復操作5次。將得到的多酚于旋轉蒸發儀上45 ℃旋轉蒸發，將旋轉蒸發后的液體用100D透析袋透析除鹽，真空冷凍干燥，即可得到谷糠結合態多酚。

本課題組在前期實驗中采用大孔樹脂柱對BPIS成分進行分離純化，使用旋轉蒸發儀濃縮至一定體積、真空凍干至粉末，用甲醇配置成溶液，通過超高效液相色譜-高分辨飛行質譜連用儀(UPLC-Triple-TOF/MS)對BPIS中主要成分進行了鑒定[11]。

1.4 BPIS作用靶點預測

將整理得到的BPIS活性成分，導入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中，得到Smiles化學式并下載其3D分子結構式，保存為SDFile(.sdf)格式。將BPIS活性成分對應的Smile化學式輸入到SEA (http://sea.bkslab.org/) 數據庫中，得到作用靶點。DRAR-CPI(https://cpi.bio-x.cn/drar/)是一種反向分子對接服務器，服務器以對接得分(Z′-score)表示活性成分與蛋白質間相互作用強度，規定Z′-score<-0.5時活性成分與靶點有結合的可能性[12]。登陸DRAR-CPI服務器，上傳BPIS活性成分的.sdf格式文件，為了提高預測準確度，選取Z′-score<-1的靶點作為藥物潛在靶點。將篩選到的靶點PDB ID導入UniProt數據庫，轉化為GeneCards數據庫對應的基因名稱(Gene name)。為了提高靶點的準確性，對兩個數據庫得到的作用靶點進行整理，作為BPIS潛在的作用靶點。

1.5 乳腺癌相關靶點預測

通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和HOME-NCBI-GENE (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)數據庫，輸入關鍵詞“Breast cancer”，設置物種為人，進行檢索，得到與乳腺癌相關的潛在靶點。

1.6 蛋白相互作用網絡構建與分析

將預測得到的BPIS 潛在作用靶點與乳腺癌相關靶點進行匹配，得到BPIS抗乳腺癌的潛在作用靶點。將靶點信息導入String 數據庫(https://string-db.org/)[13]，設置物種為人，獲取蛋白相互作用關系，將結果保存為TSV格式文件。從文件中獲取node1、node2和Combined score相關信息，并導入Cytoscape version軟件，制作蛋白相互作用網絡，并進行分析。將節點大小和顏色與degree的大小關聯，將邊的粗細與combine score的大小關聯，建立靶點蛋白相互作用網絡。

1.7 活性成分-蛋白靶點網絡構建與分析

將BPIS活性成分和抗乳腺癌潛在靶點導入Cytoscape version軟件，構建BPIS活性成分-抗乳腺癌靶點相互作用網絡。

1.8 GO和KEGG富集分析

將BPIS抗乳腺癌潛在靶點導入DAVID數據庫(https://david. ncifcrf.gov/)，將列表和背景物種限定為人，進行GO分析和KEGG通路富集分析。本研究選擇GO分析中生物過程(BP，biological process)、分子功能(MF，molecular function)和細胞成分(CC，cell component)3個模塊對基因功能進行注釋，并設置閾值P<0.05，按照靶點數目篩選排名靠前的生物功能和通路，并進行繪圖。

2 結果

2.1 BPIS對乳腺癌細胞活性有明顯抑制作用

利用濃度梯度的BPIS處理乳腺癌細胞24 h，細胞形態發生了顯著的改變，如圖1所示，MCF-7和MDA-MB-231細胞由原來的長梭形逐漸變圓，并且皺縮，發生明顯的死亡現象，而對照組MCF-10A形態無明顯變化。隨后，利用血球計數板對細胞進行計數，并統計其存活率，結果如圖2所示，MCF-10A與對照組相比無明顯變化，而MCF-7和MDA-MB-231細胞經濃度為8 μg/mL的BPIS處理24 h，細胞存活率顯著降低，表明BPIS對乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的生長有顯著抑制作用，而對正常乳腺細胞作用不明顯。

2.2 BPIS活性成分及靶點預測

通過前期對BPIS組分的鑒定，并以鑒定出的活性成分和癌癥為關鍵詞在PubMed進行文獻檢索，去除檢索結果為0的活性成分，整理得到8個BPIS化學成分，詳見表1。將BPIS活性成分導入SEA數據庫和DRAR-CPI服務器，并選取Z′-score<-1，刪除重復數據，整理得到577個作用靶點。對GeneCards數據庫和HOME-NCBI-GENE數據庫檢索結果進行整理，得到乳腺癌相關靶點1676個。將BPIS作用靶點與乳腺癌靶點進行匹配，整理得到39個BPIS抗乳腺癌潛在靶點，詳見表2。

2.3 蛋白相互作用網絡構建與分析

將篩選得到的39個潛在靶點導入String 數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”檢索得到蛋白相互作用關系網絡，結果保存為TSV格式文件，將文件中node1、node2和Combined score相關信息導入Cytoscape version軟件繪制蛋白相互作用網絡，詳見圖3。

圖中節點(node)代表作用靶點，節點的大小代表該靶點作用強度，靶點的degree等級越高，節點越大，對應的顏色由綠到紅逐漸加深。其中邊(edge)表示靶點之間的關聯，邊的粗細代表靶點間關聯的大小，靶點間Combine score 值越大，靶點間結合度越高，邊越粗。圖中共有39個節點，286條邊，平均節點度為14.7，平均局部聚類系數為0.694。其中靶點RHOA與MAPK8、靶點EGFR與CCND1和靶點PTGS 2與VEGFA相連的邊較粗，說明結合程度較大。同時，靶點INS、ESR1、HRAS和MAPK1的節點較大，說明 degree等級較大，預測以上靶點可能發揮主要作用。胰島素(INS)是由β細胞受內源性或外源性刺激，而分泌的一種蛋白質激素，能夠促進糖原、脂肪和蛋白質的合成，最新醫學數據顯示，糖尿病及糖脂代謝障礙與許多惡性腫瘤的發生有密切的關聯[14]。HRAS屬于RAS家族的小GTP酶，是癌癥中經常發生突變的致癌基因，HRAS調節復雜的信號轉導網絡，包括RAF-MEK-ERK級聯、VEGF-PI3K-AKT途徑和Raf-1信號轉導來促進癌細胞的增殖、遷移、血管生成和自噬等發生[15]。MAPK1是一類絲裂原活化蛋白激酶，據研究報道，MAPK1參與了細胞的自噬、脂代謝、增殖、遷移和侵襲等過程[16,17]?？梢灶A測BPIS主要通過對細胞的增殖、遷移、自噬和糖脂代謝的調控來發揮抗乳腺癌作用。

圖2 BPIS對乳腺癌細胞活性的影響(n=3, x±s)Fig.2 Effect of BPIS on the activity of breast cancer cells (n=3, x±s)注：*P<0.05，**P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01.

表1 BPIS中活性成分

表2 BPIS活性成分抗乳腺癌潛在靶點

續表3

序號No.基因名稱Gene nameUniProt ID蛋白名稱Protein name程度Degree介數Betweeness7ABCB1P08183多藥耐藥蛋白1Multidrug resistance protein 150.067 812 618PTGS2P35354前列腺素G / H合成酶2Prostaglandin G/H synthase 230.001 852 249GSTM1P09488谷胱甘肽s轉移酶Mu 1Glutathione S-transferase Mu 140.006 722 4510SERPINE1P05121纖溶酶原激活物抑制劑-1Plasminogen activator inhibitor 120.008 759 8611MAPK1P28482絲裂原激活蛋白激酶1Mitogen-activated protein kinase 11012GSTT1P30711谷胱苷肽S轉移酶T1Glutathione S-transferase theta-160.043 502 8213GSTP1P09211谷胱甘肽巰基轉移酶Glutathione S-transferase P30.003 121 2214CD44P16070CD44抗原CD44 antigen1015ESR2Q92731雌激素受體βEstrogen receptor beta30.000 815 2516RELAQ04206轉錄因子p65Transcription factor p6530.001 852 2417GSK3BP49841糖原合成酶激酶-3Glycogen synthase kinase-3 beta1018CYP1A1P04798細胞色素P450 1ACytochrome P450 1A130.031 687 8519PARP1P09874聚[adp -核糖]聚合酶1Poly [ADP-ribose] polymerase 11020MMP1P03956間質膠原酶Interstitial collagenase30.000 815 2521RHOAP61586轉化蛋白RhoATransforming protein RhoA60.013 908 0722PTK2Q05397局灶性粘附激酶1Focal adhesion kinase 11023MAPK8P45983絲裂原激活蛋白激酶8Mitogen-activated protein kinase 81024IGFBP3P17936胰島素樣生長因子結合蛋白3Insulin-like growth factor-binding protein 330.002 434 225HDAC1Q13547組蛋白脫乙酰酶1Histone deacetylase 140.003 614 4826FGFR1P11362成纖維細胞生長因子受體1Fibroblast growth factor receptor 11027CYP1B1Q16678細胞色素P450 1B1Cytochrome P450 1B150.067 845 628PLAUP00749尿激酶型纖溶酶原激活劑Urokinase-type plasminogen activator1029HRASP01112GTP酶HRasGTPase HRas20.008 759 8630MGMTP16455甲基鳥嘌-DNA-甲基轉移酶Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase70.054 731 7531ERBB3P21860酪氨酸激酶erbB-3Receptor tyrosine-protein kinase erbB-31032EP300Q09472組蛋白乙酰轉移酶p300Histone acetyltransferase p30040.003 614 48

續表3

序號No.基因名稱Gene nameUniProt ID蛋白名稱Protein name程度Degree介數Betweeness33SHBGP04278性激素結合球蛋白Sex hormone-binding globulin20.000 846 4134ABCC1P33527多藥耐藥相關蛋白1Multidrug resistance-associated protein 120.018 645 0535INSP01308胰島素Insulin1036CDK2P24941細胞周期蛋白依賴性激酶2Cyclin-dependent kinase 21037IL2P60568白細胞介素-2Interleukin-220.008 759 8638RARBP10826維甲酸受體Retinoic acid receptor beta60.013 908 0739CCNB1P14635G2 /有絲分裂特異性細胞周期蛋白B1G2/mitotic-specific cyclin-B110

圖3 BPIS蛋白相互作用網絡Fig.3 Protein interaction network of BPIS．注：節點的顏色和大小代表作用強度，邊的粗細代表結合度。Note: The size and the color of the node represents the value of the degree, the thickness of the side indicates the value of the combine score.

2.4 BPIS活性成分-作用靶點網絡構建

將BPIS活性成分和作用靶點相關信息導入Cytoscape version軟件，構建活性成分-作用靶點網絡圖，詳見圖4。圖中共有47個節點，107條邊，其中菱形綠色的節點代表BPIS活性成分，圓形紅色的節點代表相關靶點。由圖中可以看出，活性成分Vitexin對應22個靶點，靶點MGMT對應了7個活性成分，體現了BPIS多成分、多靶點的調節特點。

圖4 BPIS活性成分-靶點相互作用網絡Fig.4 Components-targets network of BPIS 注：綠色棱形代表BPIS主要活性成分，紅色圓形代表BPIS抗乳腺癌潛在靶點。Note: The green diamond is the main active components of BPIS，the red circle is the potential anti-breast cancer targets of BPIS.

2.5 GO和KEGG富集分析

將BPIS活性成分對應的靶點信息導入DAVID數據庫，進行GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析。根據分析結果設置閾值P<0.05，篩選得到12個生物過程，如圖5所示，分別為RNA聚合酶II啟動子轉錄正調控、藥物反應、信號轉導、MAPK級聯反應、GTP酶活性激活正調控、血管生成、細胞增殖負調控、蛋白磷酸化、細胞凋亡正調控、PI3K信號傳導正調控、ERK1和ERK2級聯正調節及細胞多脂多糖反應。細胞成分的分析結果如圖6所示，靶點主要涉及核、細胞質、質膜和胞液等。靶點涉及的分子功能如圖7所示，主要有蛋白質結合、ATP結合、酶結合及蛋白激酶活性等。其中蛋白激酶是催化蛋白質磷酸化過程的酶，在腫瘤細胞中有重要的作用。蛋白激酶Mst是在體內普遍表達的一種蘇氨酸蛋白激酶，研究發現激活Mst活性可以引起細胞凋亡[18]。

圖5 GO生物過程富集分析Fig.5 Gene Ontology (GO) analysis of Biological process

圖6 GO細胞成分富集分析Fig.6 Gene Ontology (GO) analysis of cell component

圖7 GO分子功能富集分析Fig.7 Gene Ontology (GO) analysis of molecular function

KEGG通路富集分析(圖8)發現，這些靶點主要涉及癌癥信號通路(pathways in cancer)、蛋白多糖在癌癥中的作用(proteoglycans in cancer)、PI3K-AKT信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)和ErbB信號通路等。粘蛋白(MUC1)是一種與腫瘤相關的糖蛋白，在90%的乳腺癌中高表達，且與乳腺癌患者的瘤負荷量成正比，以MUC1為乳腺癌治療的靶點可以有效的殺傷乳腺癌[19]。PI3K/AKT(絲氨酸/蘇氨酸激酶)信號通路可以通過促進細胞生長、遷移和增殖、減少凋亡等途徑促進乳腺癌腫瘤的形成，有研究表明使用小檗堿可以通過抑制AKT-mTOR信號通路，從而誘導MDA-MB-231乳腺癌細胞自噬及凋亡[20]。以上結果與文獻基本一致，表明了BPIS活性成分的相關靶點分布在不同的代謝通路，體現了BPIS多成分、多靶點協同抗乳腺癌的作用機制。

圖8 BPIS相關靶點的KEGG代謝通路富集分析Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis of BPIS potential targets

2.6 靶點通路分析

利用DAVID數據庫對BPIS相關靶點進行KEGG通路富集分析，并整合繪制出最終的通路圖。如圖9所示，將BPIS抗乳腺癌相關靶點標記為淺綠色，通路靶點標記為淺藍色。圖中顯示了EGFR/MAPK、EGFR/Ras、RhoA、INS/PI3K-AKT、CD44和VEGF信號通路可能參與了BPIS對乳腺癌細胞活性的調節。EGFR是一種具有內在蛋白酪氨酸激酶活性的跨膜受體蛋白，其活化會導致廣泛的生物反應，涉及細胞的凋亡、遷移和增殖等，而三陰性乳腺癌的特征在于EGFR的過表達和其下游信號傳導途徑的激活；有研究發現使用單克隆抗體西妥昔和一種酪氨酸酶激酶抑制劑對EGFR進行雙重靶向治療，能夠對MAPK和RAS信號通路進行抑制，可能成為三陰性乳腺癌的潛在治療方法[21,22]。PI3K/AKT信號通路在乳腺癌中往往是被激活的，且有研究發現，通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，能夠通過促進分子伴侶介導的自噬，從而抑制細胞的增殖并促進細胞的凋亡[23,24]。CD44是哺乳動物細胞表面上普遍存在的糖蛋白，研究發現其在多種實體腫瘤如：乳腺癌、肺癌和胰腺癌中高度表達[25]。實體瘤的進展取決于惡性組織中血管的形成，在一系列促血管生成因子中，血管內皮生長因子VEGF起著關鍵作用，VEGF的阻斷可導致血管網絡的消退并抑制腫瘤的生長[26]。其中EGFR/MAPK和INS/PI3K-AKT都與糖脂代謝的調節有密切聯系，同時分析結果顯示，與上述信號通路聯系最密切的死亡相關過程只有自噬，表明BPIS很可能通過調節乳腺癌細胞中的糖脂代謝促進其自噬性死亡，從而發揮特異性的抗乳腺癌作用。

圖9 BPIS抗乳腺癌潛在靶點通路分析Fig.9 Potential anti-breast cancer pathways of BPIS

3 結論

谷糠雖然是谷物加工過程中的副產品，但它含有豐富的營養元素和活性物質，其中谷糠結合態多酚具有較高的生物活性，包括抗氧化、抗高血糖、抗腫瘤和免疫調節等作用[27]。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，三陰性乳腺癌是較特殊的類型，具有惡性程度高、侵襲能力強等特點，目前缺乏有效的治療手段[28]。我們研究發現，BPIS對乳腺癌細胞具有特異性殺傷作用。本文通過網絡藥理學方法，對BPIS發揮抗乳腺癌作用的機制進行系統的分析和預測，為進一步深入研究BPIS抗乳腺癌作用提供了扎實的理論依據。

富集分析結果顯示，BPIS主要參與調控藥物反應、信號轉導、MAPK級聯反應、蛋白磷酸化等生物過程；涉及核、細胞質、質膜和胞液等細胞組分；涉及蛋白質結合、ATP結合、蛋白激酶活性等分子功能。靶點通路富集分析結果顯示：12個靶點參與PI3K-AKT信號通路(30.8%)、9個靶點參與FoxO信號通路(23.1%)、9個靶點參與Ras信號通路(23.1%)、7個靶點參與ErbB信號通路(17.9%)，其中FoxO信號、MAPK信號、PI3K/AKT信號以及INS信號都與糖脂代謝以及細胞自噬存在顯著相關性。

有研究表明胃癌組織中，自噬相關基因LC3和FoxO表達水平顯著增高[29]，且FoxO的磷酸化有助于三酰甘油轉運蛋白MTP的表達和極低密度脂蛋白VLDL的產生，促進脂類的轉運[30]。然而p38MAPK、PI3K/AKT和FoxO1的磷酸化水平與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1的表達呈負相關，其磷酸化減弱后能夠促進自噬的發生[31-33]。同時有研究表明脂代謝相關基因FTO在乳腺癌細胞中高度表達，用FTO抑制劑處理后，乳腺癌細胞中PI3K/AKT表達水平明顯降低，說明PI3K/AKT信號參與了乳腺癌細胞中的脂質代謝[34]。結合相關文獻報道以及本研究所做的相關分析，我們推測BPIS可能通過阻斷脂質轉運以及代謝，使細胞內脂質代謝紊亂，導致PI3K/AKT和FoxO等信號的減弱，從而引發細胞自噬，過度的自噬導致正常的細胞功能受損以及進一步的細胞死亡。由于腫瘤細胞本身就存在較強的自噬活動，BPIS的進一步誘導使其很容易達到自噬性死亡的最大閾值，這可能也是BPIS對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用的重要原因。

綜上所述，網絡藥理學結果顯示BPIS中8個活性成分作用于39個靶點，涉及了多個生物過程、分子功能和細胞成分。通過對蛋白相互作用網絡和BPIS活性成分-靶點網絡的構建，發現靶點之間，活性成分和靶點之間存在相互作用關系，體現了特殊醫藥食品多成分-多靶點-多途徑的作用特點。這一研究將為深入探討BPIS抗乳腺癌的作用機制以及進一步的開發利用提供科學依據。